近日，东南大学附属中大医院神经内科谢春明教授及徐州医科大学高丰雷教授团队在Advanced Materials在线发表题为Engineering EVs-Mediated mRNA Delivery Regulates Microglia Function and Alleviates Depressive-Like Behaviors”的文章。该课题从mRNA基因疗法出发，结合纳米技术，开发了一种基于工程化细胞外囊泡的治疗性MANF mRNA和纳米酶的双递送系统，通过多种途径调控小胶质细胞功能降低神经炎症水平，继而改善抑郁病理，达到抗抑郁治疗的目的，这项研究展示了一种新的抗抑郁疗法，并建立了mRNA技术用于治疗中枢神经系统疾病的新范式。
抑郁症(MDD)是一种慢性精神疾病，严重损害患者的心理社会功能，降低生活质量。药物治疗是最主要的治疗手段，但目前的临床抗抑郁治疗药物存在作用机制单一，起效缓慢，部分病人不敏感的问题，寻找新的治疗靶点，开发新的抗抑郁治疗药物是当前临床抗抑郁治疗的重要补充。
尽管MDD的生物学机制尚完全不清楚，现已揭示小胶质细胞介导的神经炎症在抑郁样行为的发展中起着关键作用，几项临床研究揭示了内质网应激（ERS）和线粒体功能障碍在精神疾病(尤其是MDD)的发生发展中存在紧密联系。内质网和线粒体之间接触的微区称为线粒体相关膜，是促进内质网和线粒体之间钙转运的平台。ERS诱导Ca2+释放到细胞质中，导致线粒体内膜去极化，并诱导线粒体活性氧(ROS)的形成，这反过来又加重了ERS。这种相互促进的关系可能导致小胶质细胞的持续激活和炎症介质的长期释放，最终诱导抑郁样行为。重要的是，mRNA疗法的最新发展为一些重大疾病的治疗提供了可能。针对以上发现，研究人员设计了基于细胞外泡囊的双递送系统（CM-sEVs），旨在穿过血脑屏障，促进中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF) mRNA和Cu NDs纳米酶同时进入大脑。这种双管齐下的方法，同时针对内质网应激和线粒体损伤及其之间的功能串扰，抑制小胶质细胞过度激活，促进小胶质细胞的M2极化，并抑制NF-��B信号通路。
图1：CM-sEVs的构建过程和作用机制
（1） sEVs介导的功能性mRNA体外递送
研究人员在体外水平研究了BV2细胞对CM-sEVs的摄取，使用DIR标记CM-sEVs后，观察到BV2细胞内CM-sEVs荧光信号随孵育时间的延长逐渐增多，并在12小时后，与内体分离，释放到细胞质进行翻译。在体外血脑屏障模型中，CM-sEVs表现出良好的血脑屏障透过性和炎症趋向性。通过免疫荧光试验和WB试验评估了MANF蛋白的有效翻译。
图2：体外水平研究 sEVs介导的功能性mRNA递送
（2）CM-sev减轻ERS，改善线粒体损伤并抑制BV2中线粒体-ER接触的增加
随后，研究人员评估了CM-sEVs通过靶向ER-线粒体串扰调节小胶质细胞功能的作用。使用内毒素LPS诱导BV2细胞建立体外炎症模型，CM-sEVs处理减少了ERS标记物CHOP和GRP78表达水平的增加。生物样本TEM图像显示， CM-sEVs处理阻止了LPS诱导的细胞器间距离的增加，并恢复了正常的线粒体结构。采用mag-fluo4和Rhod2探针分别监测内质网和线粒体中的Ca2+浓度。结果表明，CM-sEVs在一定程度上改善了Ca2+向线粒体的转移。使用mito-tracker Red标记线粒体，在共聚焦显微镜下观察它们在细胞内的形态。与对照组相比，LPS组线粒体形态模糊，碎裂，在核周聚集，而CM- sEVs将线粒体形态恢复正常。
图3：CM-sEVs通过内质网-线粒体相互作用调节小胶质细胞功能
（3）改变细胞内ROS水平可以调节小胶质细胞极化表型。在MDD的病理学中，活化的小胶质细胞产生大量的活性氧。研究者评估了CM-sEVs清除ROS的能力，在LPS诱导的炎症模型中，CM-sEVs的处理明显降低了ROS检测探针DCFH-DA的荧光信号，免疫荧光染色显示，在LPS的刺激下M1标记CD86的荧光信号显著增强，而CM-sEVs促进M2小胶质细胞的极化，表现为M2标记CD206表达增加，CD86表达减少。LPS暴露诱导BV2细胞中促炎细胞因子(IL-6、IL-1��和TNF-��)的mRNA表达上，CM-sEVs降低了促炎细胞因子的表达，增加了抗炎因子IL-10的表达，进一步表明小胶质细胞更倾向于向M2表型极化。
图4： CM-sEVs对LPS诱导的小胶质细胞活化的影响
这些发现表明ERS、线粒体损伤和氧化还原失衡可能是相互联系的，共同促成了小胶质细胞的持续活化和炎症介质的延长释放。CM-sEVs通过各种机制调节小胶质细胞，包括同时抑制ER-线粒体串扰、维持线粒体稳态和诱导小胶质细胞M2极化，从而改善神经毒素诱导的免疫反应和神经炎症。
（4）CM-sEVs改善LPS诱导的小鼠焦虑和抑郁样行为
为了评估CM-sEVs在活体动物水平减轻抑郁行为的作用，研究人员通过LPS的反复注射诱导慢性炎性抑郁模型，通过开放旷场试验来评估焦虑样行为。结果显示CM-sEVs增加了抑郁小鼠的总运动距离，增加了中央区域的停留时间和活动时间。LPS处理的小鼠在蔗糖偏好测中表现出明显较低的蔗糖偏好分数，并且在强迫游泳试验和悬尾实验中表现出较长的不动持续时，CM-sEVs改善了由LPS治疗引起的这些行为数据的异常。
此外，研究者还利用小动物7.0T MRI成像系统，进行了脑组织结构分析，结果表明，在CM-sEVs治疗前后，在杏仁皮质区后部，内侧区（COApm），皮质杏仁核区后部，外侧区（COApl），中央杏仁核，内侧部（CEAm）和中脑导水管周围灰质(PAG)区的体积发生了变化，这些发现为CM-sEVs改善抑郁行为的神经机制提供了初步的见解。
图5：CM-sEVs改善LPS诱导的抑郁样行为及相关神经机制
综上所述，研究者设计了一个基于sEVs的递送系统，成功地将MANF mRNA转运到大脑，并证实了mRNA在小鼠脑中的有效翻译。研究发现，内质网和线粒体之间的双向反馈参与了小胶质细胞的激活。这种mRNA和纳米酶协同递送的方法通过多种途径减轻小胶质细胞诱导的神经炎症反应，同时表现出良好的生物安全性和生物相容性，为治疗抑郁症或其他针对ER-线粒体相互作用的CNS炎症性疾病提供了新的参考，并强调了MANF通过调节ER应激来调节神经炎症反应的作用。这项研究为抗抑郁药物的开发提供了新的见解，证明了mRNA疗法在中枢神经系统中的应用。
东南大学医学院博士研究生葛可桢为本文的唯一第一作者，东南大学附属中大医院神经内科谢春明教授和徐州医科大学药学院高丰雷教授为本文共同通讯作者。该研究获得科技创新2030-“脑科学与类脑研究”、国家重点研发计划、国家自然科学基金面上项目、江苏省杰出青年基金等项目资助。感谢徐州医科大学公共实验研究中心董富兴博士对激光扫描共聚焦显微镜的使用给予热情帮助。（编辑王倩 校对刘敏 编审程守勤）
原文链接：https://doi.org/10.1002/adma.202418872
