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Introduction
双歧杆菌是一种具有高GC特性的革兰氏阳性杆菌，广泛分布于人类和哺乳动物、鸟类和群居昆虫的胃肠道、废水和口腔等不同的生态位。有研究指出B. animalis、B. adolescentis、B. dentium和B. catenulatum具有更广泛的生活方式，被称为“世界双歧杆菌群”。相比之下，B. bifidum、B. breve和B. longum分布相对较少，主要是在人类肠道中，并已被证明是母乳喂养婴儿肠道菌群中的优势细菌。已有大量研究报道B.bifidum具有多种有益作用，例如，对幽门螺杆菌等病原体的抗菌作用，调节宿主免疫系统，以及缓解与某些慢性肠道功能障碍相关的炎症活动。
大量Bifidobacterium的基因组分析提供了环境适应的分子证据，包括在肠道中定殖和存活。B. bifidum中存在一个大的糖双体（glycobiome），代表负责碳水化合物代谢的所有基因，包括糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GHs）、糖基转移酶（glycosyl transferases，GTs）、多糖裂解酶（polysaccharide lyases，PLs）、碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CEs）和碳水化合物结合模块（carbohydrate-binding modules，CBMs），其中GH家族特别丰富，这是基因组适应环境的证据。人类饮食中的碳水化合物（但不是母乳中存在的那些），通常代表蔬菜、谷物和全谷物中发现的多糖，被称为“膳食碳水化合物”。虽然大多数Bifidobacterium可以代谢单糖、二糖和寡糖，但在物种之间，多糖的代谢存在更多差异，如抗性淀粉、（阿拉伯-）木聚糖、（阿拉伯-）半乳聚糖和阿拉伯聚糖，它们是人类膳食的主要成分。B. longum、B. adolescentis和B. pseudocatenulatum的基因组编码多种多聚糖活性酶，这些酶预计以植物性碳水化合物为目标。
比较基因组学已经成为一种常用的分析方法，常用于鉴定菌株的遗传多样性和分析特定人群的进化结构，从而深入了解肠道共生细菌（如B. bifidum）的多样性、代谢能力和系统发育，这对我们了解目标菌株的特性非常重要。因此，借助比较基因组学手段探究不同地域人群肠道的B. bifidum遗传特性和功能是有意义的。
内蒙古农业大学食品科学与工程学院李敏博士、于洁副教授和孙志宏教授等 结合比较基因组学和功能基因组学，对分离自中国人群肠道的4株B. bifidum和NCBI已公布的106株分离自不同地域人群的B. bifidum进行分析，并探讨了该物种的遗传多样性和潜在的宿主适应性；揭示在富含膳食纤维的人群中，饮食习惯是导致B. bifidum在不同地域人群差异的主要原因之一。
Results and Discussion
不同地域人群肠道中B. bifidum分离株的基因组特征
本研究共比较了110个B. bifidum基因组，其中106个是从NCBI RefSeq数据库获得。所有菌株的基因组大小在2.14～2.55 Mb之间；GC含量平均为（62.68±0.15）%。编码序列的范围为1430～1969，平均为（1718±78）个。每个基因组平均含有（51±4）个tRNAs。根据不同的地域人群来源分为26个中国分离株、39个美国分离株、7个俄罗斯分离株和38个来源不明的分离株。通过比较基因组比较，发现俄罗斯分离株的GC含量显著低于中国和美国分离株（P＜0.05），而中国和美国分离株的GC含量没有差异。美国菌株的基因组大小明显低于俄罗斯菌株（P＜0.05），B. bifidum的基因组大小和GC含量可能存在区域差异（图1）。结果表明，不同地区的B. bifidum基因组的GC含量存在显著差异。
图1 不同地域人群B. bifidum分离株基因组比较
B. bifidum的ANI分析
所有菌株的两两配对ANI为98.02%～99.99%，证实110株B. bifidum是同一物种，不存在潜在的亚种。此外，较高的ANI值表明B. bifidum的基因组高度相似。聚类结果发现，超过一半的B. bifidum菌株具有区域相关性，其中61.54%（16/26）为中国分离株、71.43%（5/7）为俄罗斯分离株和61.54%（24/39）为美国分离株表现出明显的地域聚类趋势（图2）。
图2 B. bifidum分离株的ANI
B. bifidum的泛-核心基因组及系统发育分析
为了研究B. bifidum的遗传多样性，我们进行了全基因组和核心基因分析。泛基因组渐近曲线没有达到平台，这意味着当包含更多的基因组时，泛基因组继续增加，表明B. bifidum的泛基因组被认为处于开放状态。核心基因的曲线趋于逐渐平滑（图3A）。具体来说，在110个B. bifidum基因组中有6923个泛基因组和919个核心基因。文氏图显示了110个B. bifidum菌株的核心基因和附属基因，共有919个基因，附属基因的数量从1712到2060不等。这些结果表明，B. bifidum具有较高的遗传多样性（图3B）。
通过比较不同地域人群B. bifidum分离株的泛-核心基因组差异，发现美国分离株的泛基因组更大，核心基因更少（图3C）。中国和美国的附属基因比例高于俄罗斯（图3D）。此外，通过比较所有分离株的特有基因，我们发现三个地域人群B. bifidum分离株的基因组具有未知功能的假设蛋白质，尽管存在重叠。这反映了B. bifidum具有高度的多样性，并且在不同地区具有特定的适应机制。
通过系统发育分析进一步探索这种地域差异，基于919个核心基因构建系统发育树（图3E）。结果表明，39个美国分离株分布在每个分支中，而几乎所有的中国分离株（25/26）都聚在一个分支中。除GCF_002469385.1_ASM246938v1外，所有俄罗斯分离株都聚在一起。除美国菌株外，来自中国和俄罗斯的菌株表现出明显的地域聚集趋势。此外，重组事件通常影响DNA序列，导致多个突变位点的引入，从而影响菌株的系统发育结构。因此，提出了r/m值来衡量重组程度。r是重组引入的突变位点的数量，m是自发突变引入的突变位点的数量。110株B. bifidum的平均r/m为0.07，表明B. bifidum基因组的重组率较低，这排除了重组事件对B. bifidum系统发育结构的影响。
图3 B. bifidum泛-核心基因、附属基因及系统发育分析
B. bifidum的功能注释分析
为了探索B. bifidum的功能特征进行COG注释，结果表明其功能是全面的，涵盖了大多数生命活动，包括代谢（如氨基酸转运代谢和碳水化合物转运代谢）、信息储存和处理、细胞过程和信号以及未知功能。其中，最核心的功能是代谢，占所有功能的39.3%，碳水化合物代谢位居第二，仅次于氨基酸。B. bifidum的碳水化合物和氨基酸代谢基因分别占全部基因的10%和12%。21.52%的功能目前尚不清楚，而23.29%的功能是信息储存和处理，细胞过程和信号。这些结果表明，B. bifidum需要足够的基因组来适应宿主或饮食来源的碳水化合物代谢。
B. bifidum碳水化合物的预测分析
为了阐明B. bifidum中碳水化合物详细利用情况，基于CAZy数据库注释110个B. bifidum。结果表明，B. bifidum基因组中存在多种类型的CAZys。共确定了77个CAZys，包括45个GHs、14个CBMs、11个GTs和7个CEs。GH家族特别丰富，占总家族的58.44%，占据优势地位。其中，GH84、GH33、GH20、GH2、GH13_11、GH112和GH109基因的数量明显高于其他GH家族，主要参与纤维素代谢和宿主多糖的降解。CBM32是CBM家族的最高成员，在所有B. bifidum菌株的CAZys中含量最丰富，有助于结合粘蛋白核心结构中遇到的碳水化合物。GT2和GT51是GT家族中基因数较高的成员，主要参与淀粉或蔗糖的代谢。CE12、CE10和CE1显著高于其他CE家族成员，主要参与纤维素和半纤维素的降解过程（图4A）。为了进一步表征bifidobacteria中B. bifidum的碳水化合物利用，将这些基因组与人类肠道微生物群B. bifidum的569个公开可用的基因组进行了整合，并比较CAZys基因的组合。我们计算了每个物种的基因拷贝数，并在B. bifidum中鉴定了6个具有丰富特征的CAZys基因。其中四种含有参与植物和宿主多糖降解的酶，一种酶降解乳寡糖。因此，植物源多糖的可利用性可能是B. bifidum的特征表型。通过比较来自不同区域的CAZys基因，发现在CAZys基因中有18个区域差异，包括9个GHs、4个GTs、3个CEs和2个CBMs，具体为GH13、GH42、GH43、GH1、GH112、GH16、GH25、GH43_34、GH5_35、GT2、GT39、GT8、GT81、CE1、CE10、CE3、CBM13和CBM50。其中，俄罗斯分离株主要利用植物来源的CAZys，而美国分离株主要参与纤维素分解。这些结果表明，B. bifidum分解代谢碳水化合物的能力与富含纤维的饮食有关。
碳水化合物利用酶的聚类分析发现，来自相同地域人群B. bifidum分离株的CAZys显著聚集，但来自不同地域人群B. bifidum分离株没有明显的分离趋势，但CAZys的遗传多样性存在明显差异（图4B）。此外，中国分离株的CAZys基因多样性最高，其次是美国分离株，俄罗斯分离株最低。在中国和俄罗斯分离株中没有发现特异性CAZys，而美国分离株CAZys的特异性主要编码一种植物来源的可降解膳食纤维蛋白。这些结果表明，B. bifidum已经适应了人体肠道环境，尤其是膳食纤维丰富的人群，而饮食习惯是造成不同地域人群B. bifidum差异的主要原因之一。
图4 B. bifidum的碳水化合物功能注释分析
B. bifidum中CRISPR-Cas系统和前噬菌体的鉴定
CRISPR-Cas分析用于研究B. bifidum的获得性免疫。基于Cas标记蛋白的存在，39% （43/110）的基因组编码CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas有三种亚型，IC型（10株）、IIC型（10株）和IIA型（23株），II型系统（30%）比I型系统（9%）更常见。基于重复序列的系统发育分析，对B. bifidum的CRISPR-Cas系统进行了更详细的分类（图5A）。发现进化树的6个分支，亚型IIC、IIA和IC都有两个不同的分支；IIC的两个亚型和IIA的一个亚型位于一个大分支内，而IC的两个分支和IIA的一个亚型位于另一个大分支内，说明同一类型的CRISPR/Cas系统的重复序列在系统发育树上具有高度同源性，不同类型系统的重复序列存在变异。选择六个菌株作为每个CRISPR-Cas亚型的代表（图5B）。Cas3和Cas9蛋白分别是I型和II型的特征基因，用于区分不同的亚型。它们是靶向干扰CRISPR-Cas系统的关键蛋白质。此外，每个CRISPR-Cas系统都包含Cas1和Cas2蛋白，它们负责插入新的间隔序列，作为重要的适应性蛋白。CRISPR-Cas系统与地域位置无关，三个中国分离株的CRISPR-Cas系统都是IC型。只有一个俄罗斯分离株，其CRISPR-Cas系统是IC型。有趣的是，30个美国分离株中有90%是II型。
110株B. bifidum的89.09% （89/110）鉴定到464个前噬菌体区域。只有12株B. bifidum没有携带任何前噬菌体片段，表明前噬菌体广泛存在于B. bifidum中。来自不同地域人群的B. bifidum分离株的原噬菌体数量范围为0至15（图5C）。其中中国分离株51个，俄罗斯分离株6个，美国分离株71个。在464个预测的原噬菌体区域中，大部分标记了不确定的原噬菌体片段，183个为活性原噬菌体片段，其中38.8%分布于美国分离株，27.87%分布于中国分离株，其余分布于俄罗斯和其他国家。无论是前噬菌体还是活性噬菌体，美国分离株的前噬菌体数量都高于中国和俄罗斯分离株，而中国分离株的前噬菌体数量低于俄罗斯分离株，这与活性前噬菌体的结果相反。然而，不同地域人群B. bifidum分离株的原噬菌体数量没有统计学意义（P > 0.05）。
图5 B. bifidum的CRISPR-Cas系统和前噬菌体注释
Conclusion
本研究证实了饮食习惯导致了不同地域人群B. bifidum的差异，从而使宿主或饮食来源的复合多糖的可利用性具有特异性。可以肯定的是，碳水化合物代谢的验证需要通过未来的实验证据进一步探索。此外，B. bifidum的遗传多样性主要体现在GHs家族、CRISPR-Cas系统和原噬菌体。研究结果拓宽了对该物种的认识，为进一步研究该菌株的遗传特性和功能提供了理论基础。
第一作者
李敏，食品科学与工程学院博士研究生，研究方向为乳酸菌资源开发与利用。相关学术成果已发表于Microbiology Spectrum和Food Science and Human Wellness期刊。
于洁，博士，副教授，硕士研究生导师。主要从事乳酸菌资源库建设与生物多样性研究、益生乳酸菌基因组和蛋白组学研究和乳品发酵剂产业化关键技术方面的研究，发表60余篇学术论文，其中以第一作者和通讯作者发表SCI论文和EI论文20篇；授权发明专利5项；主持国家自然科学基金面上项目等科研项目8项。入选内蒙古自治区“草原英才”工程青年创新人才、内蒙古自治区高等学校青年科技英才支持计划，获得神农中华农业科技奖-优秀创新团队奖、内蒙古科技进步一等奖、内蒙古自然科学奖二等奖、长城食品安全科学技术奖等奖励。
通信作者
孙志宏，博士，内蒙古农业大学物品生物技术与工程教育部重点实验室研究员、博士研究生导师，获国家自然科学基金杰出青年科学基金资助 ，国家优青。主要从事乳酸菌功能基因组与肠道微生物方面。发表学术论文88篇，授权发明专利23项，参编学术专著3部，获教育部技术发明一等奖、内蒙古自治区科技进步奖一等奖、内蒙古自治区自然科学二等奖和教育部科技进步二等奖等科技奖励，荣获内蒙古自治区“优秀科技工作者”称号和内蒙古自治区青年创新人才奖。
Comparative genomic analysis revealed that dietary habits affected the adaptation of Bifidobacterium bifidum to the intestinal tract in different geographic populations
Min Lia,b,c,1, Jie Yua,c,d,1, Weicheng Lia,c,d, Qiong Wua,b,c, Jiaqi Suna,b,c, Zhihong Suna,b,e,*
a Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Ministry of Education, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
b Key Laboratory of Dairy Products Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
c Inner Mongolia Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
d Collaborative Innovative Center for Lactic Acid Bacteria and Fermented Dairy Products, Ministry of Education, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
e Center for Applied Mathematics Inner Mongolia, Hohhot 010018, China
1 Both authors contributed equally.
*Corresponding author.
Abstract
Recent research on the genome of Bifidobacterium bifidum has mainly focused on the isolation sources (intestinal tract niche) recently, but reports on the isolation region are limited. This study analyzed the differences in the genome of B. bifidum isolated from different geographical populations by comparative genomic analysis. Results at the genome level indicated that the GC content of American isolates was significantly higher than that of Chinese and Russian isolates. The phylogenetic tree, based on 919 core genes showed that B. bifidum might be related to the geographical characteristics of isolation region. Furthermore, functional annotation analysis demonstrated that copy numbers of carbohydrate-active enzymes (CAZys) involved in the degradation of polysaccharide from plant and host sources in B. bifidum were high, and 18 CAZys showed significant differences across different geographical populations, indicating that B. bifidum had adapted to the human intestinal environment, especially in the groups with diets rich in fiber. Dietary habits were one of the main reasons for the differences of B. bifidum across different geographical populations. Additionally, B. bifidum exhibited high diversity, evident in glycoside hydrolases, the CRISPR-Cas system, and prophages. This study provides a genetic basis for further research and development of B. bifidum.
Reference:
LI M, YU J, LI W C, et al. Comparative genomic analysis revealed that dietary habits affected the adaptation of Bifidobacterium bifidum to the intestinal tract in different geographic populations[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(5): 3006-3017. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250243.
本文编译内容由作者提供
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片来源：图虫创意
为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。
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