“我们首次在接近生理浓度（毫摩尔级别）的镁离子环境下，直接观察到 RNA 分子的动态行为，完全颠覆了对 RNA 的传统认知。”美国国家癌症研究所王运星教授表示。
他所提到的，是其团队近期在Nature同一期连续发表两篇“背靠背”论文中的研究结果 [1-2]。他们开发了一种解析单个分子核糖核酸（RNA，RibonucleicAcid）三维结构的新方法 HORNET，该方法结合了深度神经网络和 RNA 在溶液中的原子力显微镜成像。
值得关注的是，这是绝对意义上的单分子结构三维结构，无需对多个分子的信号进行叠加进而增强信噪比。因此，该方法非常适用于检测大型 RNA 分子在溶液中的不同构象状态。
审稿人对该研究评价称，这是 RNA 研究领域的重大突破，无论是在技术开发方面，还是对 RNA 折叠与动态性的根本性概念方面，都具有重要意义。
图丨论文通讯作者王运星（来源：资料图）
HORNET 方法在 RNA 药物开发中具有潜在应用价值，例如优化 RNA 药物设计和提高药物研发效率等。该研究有望突破当前 RNA 药物研发的瓶颈，显著拓宽 RNA 药物的研发范围。此外，其还可用于研究基础生物学研究、RNA 折叠机制探索以及 RNA 介导的基因调控等。
刷新传统认知：更正过去 60 多年关于 RNA 结构观念的误导
过去，人们普遍认为一条蛋白质初级序列只能折叠成单一（即“一对一”）或极少数的三维结构。经过 60 多年的发展，人们能够基于蛋白质初级序列，利用 AI 辅助算法和结构数据库预测其三维结构，并设计出自然界中不存在的全新蛋白质。2024 年，诺贝尔化学奖授予了计算蛋白质设计和基于 AI 的蛋白质结构预测。
然而，RNA 结构生物学领域并未取得类似蛋白质结构生物学的成功。实验解析 RNA 结构的关键挑战在于，研究方向往往聚焦在探索完美的溶液条件，使 RNA 分子折叠成便于用现成的工具和方法来解析结构。
这在很大程度上受到了过去 60 多年关于 RNA 结构的错误观念的影响。王运星实验室的研究结果颠覆和更正了这些观念，并提出了用“准等能量”分子构象转换概念，来概括全新的 RNA 分子在溶液中的行为。
实际上，RNA 分子的灵活性和异质性对其生理功能和活性至关重要，单一的 RNA 初级序列能够形成多种甚至无数种三维结构或构象，但这一假想从未得到直接实验上的证实。
镁离子对 RNA 的折叠起到非常关键的作用，而结构数据库中记录的 RNA 结构大多是在极端溶液条件下（高浓度镁离子）测定的，而非生理条件下的真实情况。
传统的间接方法，例如核磁共振、X 射线晶体学和冷冻电镜在生理相关的镁离子浓度下，无法解析具有高度异质性构象的 RNA 三维结构，尤其在每个单分子的结构和构象彼此显著不同的生理条件下会失效。因此，要实现 RNA 在生理条件下的真实结构解析，需要发展新的概念和技术。
“眼见为实”：直接观察到 RNA 单个构象体三维结构
2013 年，该团队通过小角 X 射线散射技术，首次揭示了 HIV-1 RRE RNA 在溶液中呈现“A”形构象。然而，由于这是一种间接的方法，无法得出更真实的结论。于是，他们开始使用原子力显微镜图像，可以大致看出三角形的图像。后来，随着技术的进步，课题组成员开始进一步处理这些图像。
2020 年年初，他们得到的图像已经能够清晰地显示出“A”的形状，但由于原子力显微镜的分辨率限制（约 11-12Å），仍然无法确定从图像中得出结构的准确结构。2023 年，王运星实验室首次通过直接的显微镜观察图像展示了 RNA 结构的不同构象 [3]。
在该研究中，研究人员采用原子力显微镜直接观察到 RNA 单个构象体大致三维结构，无需通过信号平均增强信号来获取结构。为克服原子力显微镜分辨率低的瓶颈，研究人员通过机器学习、神经网络以及一种新的准结构数据库，来估算确定结构的准确性。
他们生成了一个覆盖 RNA 全构象空间的大型准结构数据库，通过用准结构数据库以及来自不同来源、尺寸和形状的 RNA 分子对神经网络算法进行训练，并用其来估算由原子力显微镜图像确定的未知结构模型的准确性。
（来源：资料图）
王运星指出，在通过大规模溶液动力学计算得到可能的结构模型后，用 HORNET 确定 RNA 结构模型的准确性非常高效，仅需约 5-30 分钟即可完成（注：整个过程，包括前期大规模模型计算需要约一个星期时间）。
HORNET 能够在溶液中对灵活分子的单个 RNA 构象体结构进行解析，其分辨率优于 5Å，这对于灵活分子而言非常有意义。
图丨 HORNET 的整体工作流程（来源：Nature）
“我们的研究结果是直接观察到的现象，而不是基于间接方法的推断。除了技术上的突破，还完全颠覆了过去的 60 多年以来关于 RNA 初级顺序和三维结构关系问题的基本概念。”王运星说。
需要了解的是，RNA 的核心不在于单一高分辨率结构，因为在溶液中 RNA 非常动态且灵活并随时间变化，无法仅通过在某一时间单一或少量高分辨率结构来真实表征。因此，表征 RNA 结构和动态特性的适当方式应是确定构象体集合的三维拓扑结构。
研究人员利用 6 个基准案例对 HORNET 的实用性进行了验证，且以 RNase P RNA 和 HIV-1 RRE RNA 两个实例作为解析，展示了分子在溶液中的构象异质性。
图丨从原子力显微镜图像中提取的 RNA 结构（来源：Nature）
近日，相关论文发表在Nature，题目为《利用原子力显微镜和深度神经网络确定 RNA 构象的结构》（Determining structures of RNA conformers using AFM and deep neural networks）[1]。
美国国家癌症研究所博士后玛克西米莉娅·F·S·德根哈特（Maximilia F. S.Degenhardt）是第一作者，王运星教授为通讯作者。
图丨相关论文（来源：Nature）
为药物设计提供完整的结构动力学基础
基于 HORNET 方法，该课题组首次在接近生理条件下，绘制 RNA 的完整结构和构象空间，并揭示了 RNA 在溶液中全新行为。
研究人员发现，RNA 的不同三维构象之间可以相互转化，并且这种转变几乎是零能量的（准等能量变化）。这一发现打破了学术界和这一领域里的传统的认知。他们解析了 158 个 RNA 结构，再次证明同一个初级序列可以折叠出多种不同的结构。
该团队展示了 RNase P RNA（注：RNase P 酶是细胞里最基本且极为重要的酶之一，而 RNA 是其催化机理的核心）在生理条件下溶液中的构象异质性。
研究发现，RNase P RNA 涵盖了高度灵活的外围结构片段，并且发现此 RNA 中存在一个构象不变的核心。这些结构片段在多个方向上以 20–60Å 的幅度广泛地探索构象空间，且几乎不消耗能量，而此构象不变的核心的结构却保持同一结构。
（来源：Nature）
此外，相关分析表明，RNA 的初级序列决定了关键区域的结构和动态功能。这些发现揭示了 RNase P RNA 在保持酶促精确性与底物多样性方面的结构-动态基础。
近日，相关论文发表在Nature，题目为《溶液中 RNase P RNA 的构象空间》（The conformational space of RNase P RNA in solution）[2]。
美国国家癌症研究所博士后李云彩（Yun-Tzai Lee）和玛克西米莉娅·F·S·德根哈特是共同第一作者，王运星教授为通讯作者。
图丨相关论文（来源：Nature）
总体来看，HORNET 方法实现了在溶液条件下，对单分子 RNA 多构象的直接可视化和结构解析。这种方法能够提供完整的 RNA 构象空间和动态性信息，明确指出哪些结构区域是柔性的，哪些是固定的，从而为靶向药物设计提供更精准的信息。
该研究首次确定了灵活 RNA 中的不变区域（invariable region，即“构象不变的核心”），这些区域对药物设计开发的确定精确关键靶点和结构基础研究具有重要意义，HORNET 确定的不变区域能够指导靶向药物设计，并提高设计准确性和成功率。
截至目前，美国食品药品监督管理局（FDA，Food and Drug Administration）仅批准了一种 RNA 靶向药物（Risdiplam，用于治疗脊髓性肌肉萎缩症），其他针对 RNA 的化合物失败的部分原因之一在于缺乏对构象空间的完整和准确的信息和描绘，且药物设计是基于在非生理高镁离子浓度下获得的静态结构，和实际情况大相庭径。
这项研究更新了人们对 RNA 序列、三维结构和功能关系的传统认识。其标志着结构生物学从解析静态结构的“快照”，朝向获取分子动态结构“电影”研究方向的转变。
“在此之前，没有其他方法能够仅基于单个分子的实验信息确定任何单个分子或构象体的结构，以及获得关于 RNA 分子完全构象空间，HORNET 方法首次实现了这一目标。”王运星表示。
相较于传统方法，HORNET 方法的仪器成本相对较低。该研究解决了在溶液中解析 RNA 异质结构的挑战，有望对 RNA 结构生物学的基础研究产生深远影响。
该方法还为研究长链 RNA（如长非编码 RNA，lncRNA 使用）提供了新途径。要知道人类基因组中编码蛋白质的部分不到 3%，而超过 80% 的人类基因组会被转录为 RNA，它们在生物系统中扮演重要角色，但其结构和动态特性难以通过传统方法进行研究。
通过完整的构象空间映射，HORNET 方法能够提供 RNA 结构动态性的信息，有助于设计更稳定和特异性更高的药物。基于以上原理，研究人员还设计了一系列多肽分子，这些多肽对 HIV-1 RRE RNA 的结合力甚至高于自然的 Rev 蛋白。
选择“少有人走”之路：追求科学上的原创性和根本性突破
这项研究的起源可追溯到 30 年前，王运星教授在研究生时期提出的 RNA 构象异质性假说。当时，他通过核磁共振技术研究 RNA 的光谱线宽问题，推测到其异质性。
在过去的 20 多年中，王运星始终追求科学上的原创性和根本性突破。“我认为应该多提出创新想法，即便是教科书中和普遍接受的认知也未必一定是正确的，应该把重点放在探索和更新知识。”王运星说。
正是坚持了这种科研精神，他带领团队开发了一系列新方法和新技术，来应对研究 RNA 结构和动力学的挑战：从创新性地利用小角 X 射线散射描绘 HIV RNA 的重要分子拓扑结构，为 RNA 结构研究提供新的维度；到世界首个 RNA 标记技术与 RNA 精确标记设备，大幅提高了 RNA 研究的精度和效率；再到全球首次使用 X 射线自由电子激光捕获 RNA 中间态结构，为研究 RNA 的动态过程开辟了新途径。
王运星指出，这些成果不仅巩固了 RNA 异质性研究的基础，还为药物开发、基因治疗及 RNA 设备的未来应用奠定了坚实的理论和技术支持。
当下，该课题组的研究重点是使用正交技术（orthogonal technology），进一步证明 RNA 的构象异质性。据介绍，这部分研究目前已经取得突破性进展。
现阶段，该团队致力于利用大语言模型直接将原子力显微镜图像转化为分子坐标，简化结构解析流程和工具，从而为领域提供研究 RNA 分子更有用的工具，以及为 RNA 药物设计和基因治疗提供全新的解决方案。
此外，该课题组还希望利用 RNA 控制基因表达的独特优势开发新型 RNA 元件，以用于生物医学和临床应用。
参考资料：
1.Degenhardt, M.F.S., Degenhardt, H.F., Bhandari, Y.R. et al. Determining structures of RNA conformers using AFM and deep neural networks.Nature(2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07559-x
2.Lee, YT., Degenhardt, M.F.S., Skeparnias, I. et al. The conformational space of RNase P RNA in solution.Nature(2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-08336-6
3.Ding, J., Lee, YT., Bhandari, Y. et al. Visualizing RNA conformational and architectural heterogeneity in solution.Nature Communications14, 714 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36184-x
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