本文系Food Science and Human Wellness原创编译，欢迎分享，转载请授权。
Introduction
根据世界卫生组织（WHO）的数据，心血管疾病（CVDs）是全球首要死因。他汀类药物属于竞争性抑制剂，因为它们具有能与L结构域结合的疏水基团，从而阻断了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）。最常见的他汀类药物有普伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、氟伐他汀和匹伐他汀。然而，治疗依从性差和中断治疗是全球范围内持续存在的问题，这会增加心血管疾病（CVDs）的发病风险。除了治疗，预防是有效的主动医学的关键策略，从而降低与生活方式相关疾病的风险，同时减少国家卫生系统为保证慢性药物治疗所需的成本。食物来源的生物活性肽是由2～20个氨基酸组成的序列，这些序列在母体蛋白质中无活性，但在消化过程中通过酶水解作用被释放出来。通过色谱法、超滤法和质谱法等过程，可以从整个水解产物中分离、纯化和鉴定特定的生物活性肽（图1）。众多食物来源的肽所引发的类他汀效应（图2）备受关注。因此，本综述纳入了所有报道植物和动物来源的肽通过抑制HMG-CoAR酶活性而产生降胆固醇作用的研究。
图1 蛋白质水解物和生物活性肽生成过程的流程图
图2 生物活性肽对HMG-CoA活性作用机制的示意图
植物来源的肽
植物食品衍生的肽已被证明具有多种健康效应，包括抑制HMG-CoAR酶活性。截至目前，来自十种不同植物食品（如苋菜、黑眼豆、大麻、大豆、羽扇豆、奇亚籽、鹰嘴豆、绿豆、橄榄和鸽豆）的肽已被证明能够抑制HMG-CoAR活性（表1）。
表1 在体外和体内实验中具有抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoAR）活性的蔬菜源肽
豆类
豆类是属于豆科（Fabaceae）的一类植物，其特征在于在荚果内产生种子。豆类蛋白中提取的肽具有多种对人类健康有益的特性，如降血糖、降脂和抗癌作用。在这一背景下，众多豆类蛋白，如豇豆、大豆、鸽豆、绿豆和羽扇豆，已被用作生成HMG-CoA还原酶抑制肽的起始底物。
豇豆
豇豆（Vigna unguiculata）是一种重要的淀粉质粮用豆类作物，在撒哈拉以南非洲、亚洲和美洲均有种植。越来越多的证据表明，由于存在降胆固醇肽，豇豆蛋白可能是一种能够降低高胆固醇血症的功能性食品。通过使用胃蛋白酶（37 °C，3 h，pH 2）和胰酶（37 °C，3 h，pH 7）水解豇豆，鉴定出82种具有HMG-CoAR抑制活性的肽序列。最后，根据分子量较低、存在疏水残基（苯丙氨酸、酪氨酸（Tyr）或亮氨酸（Leu））和芳香环以及肽排名得分，对13种肽进行了研究。在一项对接研究中评估了这些肽与HMG-CoAR底物结合位点相互作用的可能性后，三肽IAF、QGF和QDF被确定为HMG-CoAR活性抑制剂（在500 μmol/L浓度下分别降低69%、77%和78%；图3）。
图3 食物来源肽对HMG-CoAR活性的半最大抑制浓度（IC50）值
羽扇豆
羽扇豆是羽扇豆属的种子，营养上富含蛋白质（39%）、纤维和微量营养素，异黄酮和其他抗营养物质（即植酸）含量低。在过去十年中，由于其显示出的多效性，对来自3个主要物种（白羽扇豆、窄叶羽扇豆和黄羽扇豆）的生物肽和蛋白质水解物的生产、表征和应用产生了极大的兴趣。来自胃蛋白酶肽的P3（YDFYPSSTKDQQS）、P5（LILPKHSDAD）和P7（LTFPGSAED）以及来自胰蛋白酶肽的T9（GQEQSHQDEGVIVR）分别以50–70、147.20、68.40和99.50 µmol/L的IC50抑制HMG-CoAR活性（图3）。对P肽的其他研究表明，P5易受Caco-2细胞表面暴露的氨肽酶活性的影响，产生代谢物P5-met（LPKHSDAD）。同样，P7也易受氨肽酶和内肽酶的作用，导致代谢物的形成：TFPGSAED和LTFPG（P7-met）。来自窄叶羽扇豆的蛋白质水解产物也对HMG-CoAR活性具有抑制作用。用Alcalase（50°C，15分钟，pH 8）水解产生的蛋白水解产物分别在0.5、1.0和2.5 mg/mL时将HMG-CoAR活性抑制了16%、34%和51%。
大豆
大豆是优质蛋白质（35%～40%蛋白质）的丰富来源，并且包含所有必需氨基酸。两种主要的储存蛋白是β-伴大豆球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S），占大豆总蛋白的80%～90%。用胃蛋白酶水解大豆球蛋白产生的肽（25～60 °C，2～24 h，pH 1.5～3.5）对HMG-CoAR活性产生抑制作用（约40%）。经过色谱研究，鉴定了肽IAVPGEVA（其以约200 µmol/L的IC50抑制HMG-CoAR活性）以及肽IAVP和IAVPTGVA（其IC50分别为59.30和93.30 µmol/L；图3）。动力学实验表明，所有这些肽都与L结构域以竞争性抑制方式起作用，而IAVP还与S结构域竞争（图4）。口服大豆球蛋白肽LPYPR（其在体外以200 µmol/L抑制HMG-CoAR 34%活性）可使大鼠血浆总胆固醇降低25%，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）降低30%。
图4 食物来源肽在HMG-CoAR抑制中的作用机制示意图
鹰嘴豆
鹰嘴豆（Cicer arietinum）是一种一年生植物，是仅次于干豆和豌豆的第三大豆类作物。鹰嘴豆蛋白质含量在总干籽粒中所占的比例变化很大（17%～29%）。鹰嘴豆作为一种功能性食品正日益被消费者接受，因为它是蛋白质、碳水化合物、矿物质、维生素、叶酸、β-胡萝卜素和健康脂肪酸的廉价来源。用Alcalase（50 °C，4 h，pH 7）水解鹰嘴豆肽在高脂饮食诱导的肥胖大鼠中的降脂活性。用这些肽（200 mg/kg）治疗6周后，与对照组相比，大鼠的肝脏HMG-CoAR活性较低，血清总胆固醇、甘油三酯和LDL-C含量显著降低，血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）增加。他们鉴定了肽VFVRN，其在0.40 mmol/L时可抑制HMG-CoAR活性64.38%。迄今为止，尚未进行对接研究来确定这种肽或鹰嘴豆肽中其他肽的抑制机制。
菜豆/木豆
木豆（Cajanus cajan）在世界栽培面积和产量方面排名第六。它是蛋白质（20%～22%）、碳水化合物（40%～60%）、矿物质和维生素的丰富来源。木豆的营养成分与豇豆相似，其氨基酸含量与大豆相似。3种木豆衍生的肽（NALEPDNRIESEGG、NALEPDNRIES和PFVKSEPIPETNNE）通过与HMG-CoAR酶的S结构域相互作用，阻断胆固醇合成，在250 µmol/L时分别抑制HMG-CoAR活性70%、50%和40%。
种子（Seeds）
种子，包括大麻（Cannabis sativa）、苋菜（Amaranthus cruentus）和奇亚籽（Salvia hispanica），自古以来就是人类重要的饮食成分。目前，它们与水果、谷物和不饱和脂肪酸一起构成了已知的地中海饮食，并且由于其健康益处，最近被指定为“超级种子”。种子是常量营养素、微量营养素和生物活性化合物的重要来源。关于蛋白质含量，种子由14%～31%的蛋白质组成，其中包含所有必需氨基酸。由于这些原因，在过去十年中，对来自蛋白质种子的衍生肽进行了广泛的研究。
大麻
大麻籽含有超过35.5%的油（富含多不饱和脂肪酸）、25%的蛋白质、20%～30%的碳水化合物、28%的总纤维（5.4%可消化，22.2%不可消化）和5.6%的灰分。此外，大麻籽蛋白是高度可消化氨基酸的极好天然来源。由于蛋白质含量高，在过去十年中，人们对研究大麻籽蛋白和肽的有益特性的兴趣有所增加。胃蛋白酶和胰蛋白酶水解产物是HMG-CoAR活性最有效的抑制剂，分别降低80%和93%，这与胰酶衍生的肽的作用较低不同。这一事实是由于胰酶水解产物含有大量亲水性氨基酸，如Glu、丝氨酸（Ser）、Arg和Lys，而脯氨酸（Pro）和缬氨酸（Val）含量较少，这在其他水解产物中含量丰富。此外，在胃蛋白酶水解产物中鉴定出的肽有一半是疏水性的，这与降胆固醇作用有关。
苋菜
苋菜籽是一种蛋白质含量高的谷物（17%），其氨基酸组成接近人类饮食所需的最佳氨基酸平衡。研究证明，通过用多种酶混合物（胰蛋白酶＋α-糜蛋白酶＋肽酶，37 °C，10 min，pH 8）水解获得的苋菜蛋白水解产物，在4.0 µg/mL时可抑制HMG-CoAR活性约55%。从这种水解产物中鉴定的肽GGV、IVG和VGVL在相同浓度（4.0 µg/mL）下对HMG-CoAR活性的抑制作用约为40%。尚未进行对接研究来确定这些肽的结合域。
奇亚籽
奇亚籽是蛋白质的良好来源，约占其质量的18%～24%。大量研究表明，奇亚籽具有很高的生物活性和健康促进特性。用风味蛋白酶获得的富含蛋白质的组分的水解产物在1.0 mg/mL时具有最高的抑制活性（81%）。用风味蛋白酶水解导致释放的肽中，第一个N端氨基酸可能是Pro。因此，Pro的特征性扭转角的存在可以产生类似于他汀类药物的3D结构，从而抑制HMG-CoAR活性。
其他蔬菜
除了上述肽来源外，在其他蔬菜来源的肽中也研究了HMG-CoAR活性的抑制作用。 用Alcalase（50 °C，4 h，pH 8.5）水解生的“曼萨尼亚”橄榄获得的肽在3.1 mg/mL时可降低HMG-CoAR活性17%，在26.7 mg/mL时可降低40%。 给高脂饮食小鼠服用这种水解产物（400 mg/kg）8周后，总胆固醇、LDL-C、HDL-C和动脉粥样硬化指数降低。 为了确定哪些肽可能对降胆固醇作用负责，鉴定了33种不同的肽，这些肽具有高含量的疏水性氨基酸，其中ADLY、FLPH、KLPLL和TLVY含量最多。 没有进行对接研究来确定这些肽的可能作用机制。
动物来源的肽
尽管大多数科学研究都致力于研究植物来源的肽对HMG-CoAR活性的抑制作用，但也有其他研究评估了动物来源的肽（表2）。
表2 动物源肽在体外实验中对HMG-CoAR抑制活性的研究
评估了用α-葡萄糖苷酶（37 °C，5 min，pH 6.8）水解伊比利亚干腌火腿蛋白获得的17种二肽的HMG-CoAR活性抑制作用，观察到二肽DA、DD、EE、ES、LL、AA、AL、AQ、QQ和VH对HMG-CoAR活性具有有效的抑制作用，其中前五种肽的抑制作用最强，为40%～60%。作者得出结论，肽的低分子量、酸性氨基酸Asp和Glu的存在（尤其是在C端位置）和/或N端的Leu残基是有利于与酶相互作用的因素。此外，具有最高抑制活性的肽具有亲水性，肽的疏水性（Ho）与HMG-CoAR的抑制能力之间存在负相关。这一方面有些争议，因为其他作者已经证明疏水性肽具有更好的活性。因此，肽的疏水/亲水特性不是参与HMG-CoA活性抑制的唯一因素，肽的其他理化特性也参与其中。计算机模拟对接研究表明，伊比利亚干腌火腿肽占据与催化结构域中HMG-CoA底物相同的结合位点，可能是通过建立氢键、疏水相互作用和/或盐桥。
来自海洋产品（如鱼）皮胶原蛋白或发酵鱼的肽也已被证明通过抑制HMG-CoAR活性发挥降胆固醇作用。具体而言，用胶原酶（来自Bacillus licheniformis）水解鱼皮可抑制HMG-CoAR活性25.8%。此外，已证明通过用乳酸菌（Lactobacillus acidophilus）发酵获得的来自条纹鳢或波鱼的肽可抑制HMG-CoAR活性＞70%。然后从这些水解产物的＜10 kDa组分中鉴定出肽KGENYNTGVTPNLRPKAAEVVAFLNKEAIEAIADTMKK，因为该组分显示出最佳的HMG-CoAR抑制率（＞90%）。与他汀类药物和HMG-CoA底物相比，这种肽的大尺寸可能通过非竞争性机制抑制酶，因为它不能与HMG-CoAR酶的L-或S-结构域相互作用。
来自蚕蛹蛋白的其他动物来源肽已被证明是发挥多种对人体健康有益作用的肽的重要来源。通过用中性蛋白酶（52 °C，5 h，pH 7）水解获得了蚕蛹蛋白水解产物，并观察到抑制HMG-CoAR活性最有效的组分（53%）包含小于3 kDa的肽。来自该组分的肽HPP、SGQR、QPGP、CQP和NQR分别抑制HMG-CoAR活性84%、78%、56%、26%和17%。分子对接研究表明，L结构域中的氢键相互作用是HPP和SGQR抑制作用的原因。
通过计算机模拟对接研究表明，来自Etawah山羊奶αS2-酪蛋白的四种肽（NMAIHPR、ITVDDKHYQK、TNAIPVYR和TNAIPVYRL）与HMG-CoAR的活性位点相互作用。然而，没有进行体外研究来确定这些肽的抑制作用。
HMG-CoAR 活性抑制肽的理化特性分析
低分子量、脯氨酸的存在、C端部分的负电基团和/或疏水性N端基团是肽-酶相互作用以及酶抑制的重要特征。另一方面，关于Ho在酶抑制中的重要性存在不同的观点。
为了找到抑制HMG-CoAR活性的肽的共同理化特征，使用PeptideRanker和ToxinPred工具分析了先前描述的40种具有竞争性抑制作用的食物来源肽的长度、MW、Ho、电荷、肽等级评分（PRS）和环数。此外，计算了具有疏水性N端或带负电荷的C端的肽的数量。结果显示，所有测量值都具有很高的可变性，序列包含2～14个氨基酸，MW为160.20～1 730.00 Da，Ho在-1.03和0.53 kcal/mol之间，电荷在-3.00和1.50之间，PRS在0.022和0.995之间（值1.0被认为是最高值），环数在0-4之间（表3）。虽然PRS≥0.5的肽被认为是具有生物活性的，但只有25%的这些肽（已被证明能够抑制酶）超过了这个值。此外，57.50%的总肽具有疏水性N端，15%具有带负电荷的C端（表3）。
表3 抑制HMG-CoAR的肽的物理化学特性，具有与L-或S-域的特异性相互作用
由于这些食物来源的肽没有共同的理化特征，本研究旨在根据肽与酶的L-或S-结构域的结合情况来评估和比较肽。35个序列与L结构域结合，而只有8个序列与S结构域结合。肽IAVP、YVVNPDNDEN和YVVNPDNNEN能够与两个结构域结合。有趣的是，与S结构域结合的序列显示出显著的高负电荷（-1.50±1.31）、更长（（9.12±4.02）个氨基酸）和更高的MW（（1 030±503）Da），而与L结构域结合的序列没有显著差异，在Ho或环数方面没有显著差异（表3）。由于先前的研究表明，具有负C端基团和/或具有疏水性N端基团的肽分别有利于与L-和S-结构域的结合，因此计算了这些肽中存在的带负电荷的C端和疏水性N端的数量。理化分析表明，57.14%的与L结构域结合的肽含有疏水性N端，14.29%含有负C端。关于与S结构域结合的肽，75%和12.50%分别含有疏水性N端和负C端。有趣的是，其他不具有上述任何特征但能够抑制酶的肽，其L结构域竞争性肽的平均氨基酸含量为4.15个，S结构域竞争性肽的平均电荷为负值（-2.5），而Ho没有差异。
考虑到这些分析，认为这些肽介导的HMG-CoAR活性抑制不是由于单一的理化特征，因为文献中描述的肽没有共同的特征。因此，本研究认为抑制过程是由不同的理化特征协同作用引起的，而不是由特定的理化特征引起的。此外，序列分析首次表明，小尺寸肽可能通过竞争L结构域而在酶的抑制中发挥重要作用，负电荷和疏水性N端的存在通过与S结构域的相互作用而在抑制中发挥重要作用。
工业应用的未来前景：批评与挑战
在本综述中，收集了文献中报道的所有显示出对HMG-CoAR活性具有抑制作用的食物来源肽的研究。迄今为止，关于这些肽的研究很少，以证实其在体内模型中的体外抑制活性。因此，需要在动物和人类模型中进行更多的工作，以确保其生物活性。还需要进一步的研究来阐明有利于肽与酶的L-和S-结构域结合的理化特征。另一方面，应在临床试验中分析这些肽的毒理学效应。此外，尚未在大多数肽中评估穿过胃肠道屏障的能力。只有来自羽扇豆蛋白的肽LILPKHSDAD、LPKHSDAD、LTFPGSAED、LTFPG、YDFYPSSTKDQQS和GQEQSHQDEGVIVR以及来自大豆蛋白的肽YVVNPDNDEN、YVVNPDNNEN、IAVPGEVA、IAVPTGVA和LPYP已被证明能够穿过体外胃肠道屏障。此外，使用酶Alcalase®生成的羽扇豆蛋白水解物、“曼萨尼亚”橄榄水解物和鹰嘴豆水解物也已证明具有体内效应。其余肽和水解产物的生物利用度尚不清楚。因此，需要进行关于吸收、分布和代谢的研究，以便全面了解其作用机制。目前，有许多有用的测定方法可以研究这些特定生物活性水解物和肽的生物利用度，例如静态体外消化、Caco-2细胞肠道屏障模型、原位单次肠道灌注模型或计算机模拟消化理论预测模型。此外，为了实现最佳的稳定性、生物利用度和这些肽的半衰期，有必要对给药系统进行未来的研究。在微粒或纳米颗粒中的封装以及使用酶抑制剂或螯合剂是提高这些肽的生物利用度的有趣策略。
此外，负责肽对HMG-CoA活性的一些抑制作用的疏水性氨基酸已显示出强烈的苦味，还应分析新产品的适口性。另一方面，肽与药物之间或具有不同抑制机制的肽之间的协同效应对于减少他汀类药物治疗的副作用非常重要。最后，一系列合并症与高胆固醇血症（糖尿病、高血压、肥胖等）有关，因此，寻找具有多功能和多效性作用的肽，以及治疗不同病症的能力应该是未来研究方向的目标。
Conclusion
本综述中描述的生物活性肽可能代表一类新型的HMG-CoA还原酶抑制剂，可以直接与该酶相互作用，阻断胆固醇合成途径，从而预防高胆固醇血症。这些肽已被证明可以结合并竞争HMG-CoAR酶的S-和/或L-结构域，尽管其中一些肽也已被证明以非竞争性方式抑制该蛋白（图4A和B）。关于肽的理化特性，没有确定单一的因素是酶抑制的关键，似乎是理化特性之间的协同效应导致了相互作用。在这方面，低分子量、脯氨酸的存在、带负电荷的C端基团和疏水性N端基团已被指出有利于与该酶的相互作用，而肽的疏水性/亲水性与抑制能力之间没有明确的关系。尽管所有研究都指出食物来源的肽可以作为未来潜在的营养保健品用于预防高胆固醇血症，但有必要找到其在体内调节胆固醇水平的临床证据。因此，必须进行临床前和临床研究，以确认剂量反应关系、生物利用度（吸收和分布）和药代动力学。毫无疑问，本综述揭示了使用食物肽作为预防或治疗高胆固醇血症的新治疗策略的巨大兴趣和重要性，并开辟了一个有趣的新研究领域。
Food-derived peptides with inhibitory capacity for HMG-CoA reductase activity: a potential nutraceutical for hypercholesterolemia
Guillermo Santos-Sáncheza,b,*, Ana Isabel Álvarez-Lópeza,b, Eduardo Ponce-Españaa,b, Patricia Judith Lardonea,b, Antonio Carrillo-Vicoa,b,*, Ivan Cruz-Chamorroa,b
a Instituto de Biomedicina de Sevilla, Instituto de Biomedicina de Sevilla (IbiS); Hospital Universitario Virgen del Rocío; Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC); Universidad de Sevilla, Seville 41013, Spain
b Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Sevilla, Seville 41009, Spain
*Corresponding author.
Abstract
Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading global cause of mortality and disease burden. Statins are the most prescribed lipid-lowering drugs to treat hypercholesterolemia and prevent CVDs. The biochemical mechanism of statins consists of competitive inhibition of the 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase enzyme (HMG-CoAR), the limiting enzyme in cholesterol biosynthesis. Due to statin intolerance in some patient groups, the search for new inhibitors is a field of great interest. This review focusses on the studies reporting the inhibitory effect of protein hydrolysates and biopeptides on the HMG-CoAR enzyme activity. The analysis of the action mechanism and physicochemical characteristics of the HMG-CoAR inhibitory peptides revealed that the molecular weight, amino acid composition, charge, and polarity are key aspects of the interaction with the HMG-CoAR enzyme. In conclusion, this review reveals the potential of using food peptides as new cholesterol-lowering agents and opens a new interesting field of research. However, clinical approaches are mandatory to confirm their therapeutic hypercholesterolemic effect.
Reference:
SANTOS-SÁNCHEZ G, ÁLVAREZ-LÓPEZ A I, PONCE-ESPAÑA E, et al. Food-derived peptides with inhibitory capacity for HMG-CoA reductase activity: a potential nutraceutical for hypercholesterolemia[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3083-3094. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250001.
翻译：管勤昊（实习）
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
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