中药1区 | 浙工大+浙江省中揭示改良型黄风汤通过激活自噬和调节肠菌缓解糖尿病肾病

【写在前面】：本期推荐的是由浙江工业大学、浙江中医药大学第一附属医院等研究团队近期发表于Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示改良型黄风汤通过激活自噬和调节肠道菌群缓解糖尿病肾病。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Modified huangfeng decoction alleviates diabetic nephropathy by activating autophagy and regulating the gut microbiota

背景：糖尿病肾病（DN）是糖尿病患者中死亡率最高的并发症之一，可导致肾衰竭。改良型黄风汤（MHD）在肾脏疾病的临床治疗中被广泛应用。然而，MHD对DN的具体作用机制尚未完全阐明。

目的：探讨MHD对小鼠DN的影响及其潜在机制。

方法：通过液相色谱‒质谱分析确定MHD的主要成分。构建高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）诱导的DN小鼠模型，并用MHD治疗6周。检测血清和尿液参数，对组织切片进行组织学染色。通过qPCR和Western blotting检测代谢、炎症、纤维化和自噬相关标志物的mRNA和蛋白水平。通过全长16S rRNA测序和非靶向代谢组学分析盲肠内容物的微生物组成和代谢物。

结果：MHD改善了DN小鼠的胰岛素抵抗，并改善了肝脏和脂肪组织中脂质代谢和炎症的变化。此外，MHD降低了血清和尿液中肾损伤标志物的水平，并减轻了肾脏的炎症和纤维化。这些结果伴随着肠道屏障功能的增强以及肠道菌群组成和代谢物的显著改变，表现为有益菌种和代谢物的丰度增加。此外，MHD本身及微生物代谢物精脒通过激活PI3K/AKT/mTOR通路减轻了足细胞损伤。

结论：MHD可能通过激活足细胞自噬（PI3K/AKT/mTOR通路）以及调节肠道菌群及其代谢物来改善DN。我们的研究为MHD的作用机制提供了更全面的理解，并揭示了肠道‒肾脏相互作用在DN进展中的作用，为其在DN治疗中的临床应用奠定了理论基础。

（PS：不想看长篇大论的可以直接拉到文章最后看全文思路总结）

（图文摘要）

【前言】

2型糖尿病（T2D）主要由胰岛素抵抗和胰腺β细胞功能的逐渐恶化定义。其患病率在全球范围内持续上升，2021年全球约有5.37亿成年人患有T2D。预计到2045年，这一数字将显著增加，达到约7.83亿。这不仅凸显了T2D对公共卫生构成的日益严峻的挑战，也强调了加强预防和治疗策略的紧迫性。然而，糖尿病肾病（DN）的分子机制尚未完全阐明，这阻碍了有效分子干预靶点的识别和开发。目前，主流治疗主要集中在控制血压、血糖和血脂水平。自20世纪90年代初以来，血管紧张素阻滞剂（如ACEI和ARB）在DN的管理中发挥了关键作用。近年来，新型疗法（如SGLT2抑制剂、内皮素受体拮抗剂、GLP-1受体激动剂和盐皮质激素受体拮抗剂）提供了额外的治疗选择。然而，部分患者仍不可避免地进展为终末期肾病，这突显了对新疗法的迫切需求。

中医药（TCM）基于其整体理论框架，通过其生物活性成分的协同作用，在DN的治疗中表现出多层次的疗效。在植物化学水平上，单味中药具有特定的生物活性。例如，山药通过健脾补肾改善DN。此外，黄芪通过其多种植物成分调节糖脂代谢，并降低空腹高血糖、蛋白尿和肾小球高滤过等病理标志物水平。这些单味中药的疗效在复方制剂中可能通过成分的协同作用而增强。黄连解毒汤就是一个例子，它结合了四种功能不同的中药：黄连（降血脂）、黄芩（调节血流动力学）、栀子（抗炎）和黄柏（解毒），并通过激活AGE/RAGE/AKT/Nrf2通路改善DN。同样，当归补血汤由黄芪和当归组成，具有抗炎、镇痛和降血糖作用，这两种药材协同作用增强了对DN的治疗效果。这种从单味中药到优化复方制剂的层次化治疗策略，突出了系统阐明中医药多组分网络机制的关键需求，尤其是在草药处方的临床多样性背景下。

改良型黄风汤（MHD）由黄芪、僵蚕、蝉蜕、当归和防风组成，是一种用于健脾补肾的中药复方。黄芪作为主要成分，具有补气升阳的作用。从黄芪中已鉴定出100多种化合物。黄芪及其活性成分能有效降低DN小鼠的空腹血糖和蛋白尿水平，逆转肾小球高滤过状态，并减轻早期DN小鼠模型的病理变化。僵蚕、蝉蜕和当归作为辅助药材，与黄芪协同作用以增强其主要疗效。防风可帮助驱除风邪。在传统中医中，风邪是指导致身体失衡或疾病的外部因素。防风的主要活性成分包括香豆素、色原酮和多糖。其中，色原酮、prim-o-glucosylcimifugin和5-O-甲基维萨米奥苷具有显著的药理活性，包括有效的镇痛、解热、抗炎和免疫调节作用，被用作药材的质量标准。

在传统中医医院的临床实践中，MHD在治疗多种原发性和继发性肾脏疾病（包括蛋白尿、IgA肾病和DN）方面表现出显著的疗效。然而，MHD对DN的具体作用机制仍不清楚。新兴证据强调了细胞自噬在维持足细胞稳态中的关键作用，这一过程由PI3K/AKT/mTOR信号轴严格调控。在生理条件下，mTOR复合体1（mTORC1）通过磷酸化ULK1抑制自噬起始，而AKT介导的Bcl-2磷酸化则抑制Beclin-1依赖的自噬体形成。值得注意的是，持续的PI3K/AKT信号通过IRS-1的负反馈加剧胰岛素抵抗，而mTOR的过度激活则破坏足细胞自噬流，导致受损细胞器的积累和随后的肾小球滤过屏障功能障碍。因此，该通路的过度激活与DN的发病机制相关，使其成为恢复足细胞自噬的潜在干预靶点。

本研究探讨了MHD对高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）诱导的DN小鼠模型的治疗效果，并通过全长16S rRNA测序和代谢组学分析阐明了MHD通过肠道菌群及其代谢物发挥作用的机制。此外，还通过体外实验进一步探讨了MHD及其微生物代谢物对足细胞自噬的影响及其机制。

【结果】

1、MHD活性成分的植物化学分析

通过液相色谱‒质谱（LC‒MS）分析了MHD的成分，并通过与Waters传统药物库2.0比对，共鉴定出352种成分（见补充材料表S3和S4）。此外，在正负离子模式下，基于准确测定分子量、分析质谱碎片路径以及与已知对照品的保留时间比对，在LC‒MS光谱中确定了10种主要活性成分（图1A‒B）。鉴定结果显示，MHD的活性成分包括二氢香豆素、升麻苷、5-o-methylvisamminol、formononetin、毛蕊异黄酮、黄耆苷II、亚麻酸乙酯、sec-o-glucosylhamaudol和黄酮（图1C）。

2、MHD降低血糖水平并改善糖尿病小鼠的胰岛素敏感性

小鼠分组如图2A所示。从第二周开始，高脂饮食（HFD）小鼠的体重显著增加，随后在链脲佐菌素（STZ）注射后体重下降至低于对照小鼠的水平（图2B）。此外，经过高剂量MHD（H-MHD）治疗后，H-MHD治疗组小鼠的体重显著低于糖尿病肾病（DN）治疗组小鼠（p < 0.05），然后缓慢增加，而低剂量MHD（L-MHD）、MHD-D、达格列净（DSR）和达格列净（DAPA）单独使用则对体重无影响（图2B）。经过6周的H-MHD治疗后，DN小鼠的空腹血糖水平显著降低（p < 0.05）（图2C）。剂量为1 mg/kg的DAPA对血糖水平无影响（图2C）。H-MHD（p < 0.01）、MHD-D（p < 0.05）或DAPA（p < 0.05）治疗的DN小鼠血清胰岛素水平显著降低（图2D）。此外，H-MHD和DAPA通过胰岛素抵抗的稳态模型评估（HOMA-IR）指数评估，显著缓解了糖尿病诱导的胰岛素抵抗（所有p < 0.05）（图2E）。Western blot分析显示，H-MHD（p < 0.05）和MHD-D（p < 0.05）治疗增加了DN小鼠肝脏和附睾白色脂肪组织（eWAT）中磷酸化胰岛素受体β（IRβ）和AKT的水平（图2F-G）。H-MHD组在增加胰岛素信号传导方面的总体效果比MHD-D组更为显著，而单独使用DSR对胰岛素信号传导的影响较小（图2F-G）。

3、MHD改善糖尿病小鼠的代谢紊乱

与对照小鼠相比，DN小鼠的肝脏重量显著增加，而H-MHD治疗显著逆转了这一变化（p < 0.05）（图3A）。DN小鼠的血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平显著升高（p < 0.01），经MHD治疗后降低（p < 0.05）（图3B）。此外，MHD还缓解了与DN相关的高脂血症，表现为血清甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平升高（所有p < 0.05）（图3C）。MHD-D治疗导致血清ALT和TG水平降低（p < 0.05），而单独使用DSR和DAPA则对这些血清参数无影响（图3B-C）。组织学分析显示，DN小鼠的肝脏呈现增加的脂滴沉积和附睾脂肪细胞的肥大，而MHD、MHD-D和DAPA有效缓解了脂滴沉积和附睾脂肪细胞的肥大（图3D）。相比之下，L-MHD和DSR的效果不明显（图3D）。与这些发现一致，H-MHD给药后，DN小鼠肝脏和eWAT中脂生成基因（如固醇调节元件结合蛋白-1c（Srebp-1c）和乙酰辅酶A羧化酶（Acc））的相对mRNA表达水平显著降低（所有p < 0.05）（图3E-F）。相比之下，MHD和MHD-D治疗增加了与脂解和脂肪酸氧化相关的标记物（包括激素敏感性脂肪酶（Hsl）、肉碱棕榈酰转移酶1α（Cpt-1α）和过氧化物酶体增殖物激活受体α（Pparα））的相对mRNA表达水平（所有p < 0.05）（图3E-F）。MHD-D和DAPA也对这些脂代谢相关基因在肝脏和eWAT中的表达调控有轻微影响（图3E-F）。

4、MHD改善糖尿病小鼠的肾损伤

随后，我们全面研究了MHD对DN小鼠肾脏的保护作用。H-MHD治疗有效缓解了DN小鼠血清肌酐（SCR）、血尿素氮（BUN）、尿肌酐（UCR）和尿白蛋白异常升高的水平（p < 0.05），而MHD-D和DAPA治疗则适度改善了这些指标（图4A）。组织学分析清楚地显示，DN小鼠的肾脏表现出严重的肾损伤和间质纤维化，这些变化通过给予H-MHD、MHD-D或DAPA显著缓解（所有p < 0.01）（图4B）。相比之下，L-MHD和DSR未能显著减轻肾损伤（图4B）。此外，H-MHD、MHD-D和DAPA（所有p < 0.05）强烈抑制了DN小鼠促炎因子和纤维化相关基因的相对mRNA表达（图4C-D）。这些结果与DN小鼠肾脏中炎症通路和纤维化信号的减弱密切相关，这通过p65 NF-κB和p38 MAPK的磷酸化水平以及波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白的水平得到证实（图4E）。

5、MHD保护肠道屏障功能并减轻糖尿病小鼠的结肠炎症

接下来，我们研究了MHD对肠道屏障功能的影响。我们之前的研究已经明确了DAPA对肠道屏障功能和肠道菌群的影响。因此，后续实验主要关注MHD的影响。DN小鼠的结肠长度比对照小鼠短，而H-MHD和MHD-D治疗恢复了这一长度（所有p < 0.01）（图5A）。此外，H-MHD减轻了DN小鼠结肠组织中的炎性细胞浸润并增加了粘液分泌（图5B）。与组织学结果一致，H-MHD和MHD-D上调了结肠中紧密连接相关标记物（即claudin-1、occludin和zonula occludens-1（Zo-1））的mRNA和蛋白水平（所有p < 0.05）（图5C、E）。另一方面，结肠中炎性细胞因子和趋化因子（如TNF-α和MCP-1）的mRNA表达被下调，而抗炎细胞因子IL-10的表达被H-MHD和MHD-D上调（所有p < 0.05）（图5D）。相应地，H-MHD和MHD-D治疗减轻了结肠中的炎症通路，表现为p38 MAPK和p65 NF-κB的磷酸化（所有p < 0.05）（图5E）。单独给予L-MHD或DSR对肠道屏障功能和结肠炎症无影响（图5）。

6、MHD改变糖尿病小鼠肠道菌群的组成和功能

为了探讨肠道菌群在MHD改善DN小鼠中的潜在作用，我们对盲肠菌群进行了16S rRNA分析。α多样性分析显示，DN小鼠的Chao1指数和Shannon指数显著低于H-MHD治疗小鼠（p < 0.05）（图6A）。主坐标分析（PCoA）显示，对照组、DN组和不同药物治疗组之间的β多样性存在明显差异，H-MHD治疗组的空间位置接近对照组（图6B）。在门水平上，与对照组相比，DN小鼠中厚壁菌门（Firmicutes）的丰度增加，而疣微菌门（Verrucomicrobia）和变形菌门（Proteobacteria）的丰度降低；然而，这些失衡在MHD治疗后得到缓解（图6C）。随后基于相对丰度鉴定了前50种细菌，并以热图形式展示（图6D）。H-MHD增加了有益菌（如Akkermansia muciniphila、Desulfovibrio sp011039085和Clostridium cuniculi）的相对丰度，同时减少了有害菌（如Jeotgalibaca ciconiae）的相对丰度（所有p < 0.05）（图6D-E）。相比之下，MHD-D和DSR未引起显著影响（图6D-E）。此外，相关性分析显示，这四种细菌与肾损伤标志物之间存在强相关性（图6F）。

7、MHD通过调节肠道菌群代谢物改善糖尿病肾病

为了进一步鉴定可能负责MHD效果的潜在微生物代谢物，我们进行了代谢组学分析。火山图显示，与对照组相比，DN组中有168种代谢物显著增加，293种代谢物显著减少（图7A）。H-MHD、MHD-D或DSR治疗分别导致69、81和84种代谢物水平增加，以及44、53和78种代谢物水平减少（图7A）。DN和H-MHD治疗共同影响的代谢物的维恩图进一步显示了57种代谢物（图7B）。这些共同代谢物的KEGG通路分析突出了三大主要通路，即谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及β-丙氨酸代谢（图7C）。对这些通路中的代谢物分析显示，DN小鼠中精脒、亚精胺、L-谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）的水平显著降低（所有p < 0.01），而H-MHD治疗后这些代谢物的水平显著增加（所有p < 0.01）（图7D）。这些代谢物与前50种细菌的相关性分析显示，精脒和亚精胺与Akkermansia muciniphila、Salmonella enterica、Clostridium cuniculi、Extibacter sp001185345、Desulfovibrio sp011039085和Corynebacterium stationis呈显著正相关，而与Jeotgalibaca ciconiae呈显著负相关（图7E）。此外，精脒与肾损伤标志物的相关性比亚精胺更强（图7F）。

8、MHD通过激活自噬改善糖尿病小鼠的肾小球损伤

为了进一步明确MHD保护肾功能的机制，我们对糖尿病肾病（DN）小鼠肾脏中的足细胞标记物Wilms’肿瘤1（WT-1）进行了qPCR和Western blot分析。DN小鼠肾脏中WT-1的mRNA和蛋白水平显著降低，而高剂量MHD（H-MHD）和MHD-D显著增加了WT-1的表达（所有p < 0.05），低剂量MHD（L-MHD）和达格列净（DSR）则无此效果（图8A-B）。肾脏切片的免疫荧光染色显示，DN组足细胞丢失明显，而MHD或MHD-D治疗（所有p < 0.001）减轻了肾小球损伤（图8C）。鉴于足细胞自噬在糖尿病肾脏病变中的作用，我们评估了自噬信号。DN小鼠肾脏中自噬相关基因（如Lc3b和Beclin1）的mRNA表达显著下调（p < 0.05），而H-MHD和MHD-D显著上调了这些基因的表达（所有p < 0.05）（图8D）。自噬底物p62则呈现相反的趋势（图8D）。这些结果进一步通过LC3B和p62的蛋白水平得到验证（图8E）。同样，L-MHD和DSR对自噬信号无显著影响（图8D-E）。

9、MHD和微生物代谢物精脒减轻高糖诱导的MPC5足细胞损伤

为了进一步探讨MHD和微生物代谢物精脒在足细胞损伤中的作用，我们采用了高糖（HG）诱导的足细胞损伤体外模型。通过MTT实验确定了细胞实验中MHD、MHD-D和DSR的使用浓度（图S1）。与体内研究结果一致，HG诱导的WT-1表达下调通过qPCR、Western blot和免疫荧光染色评估，显著被MHD和MHD-D逆转（所有p < 0.05）（图9A-C）。精脒处理对WT-1水平的影响（图9A-C）。此外，MHD（p < 0.01）、MHD-D（p < 0.05）和精脒（p < 0.05）通过下调炎性细胞因子和趋化因子的表达以及减少p38 MAPK和p65 NF-κB的磷酸化，减轻了细胞炎症（图9D-E）。单独使用DSR对足细胞损伤无显著影响（图9）。

10、MHD和精脒通过PI3K/AKT/mTOR通路增加足细胞自噬

HG处理导致MPC5细胞中自噬通路相关基因的mRNA和蛋白水平显著下降，这些变化被MHD、MHD-D和精脒逆转（所有p < 0.05）（图10A-B）。此外，双重免疫荧光染色显示，经MHD、MHD-D和精脒处理后，足细胞中LC3和溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）的表达增加（所有p < 0.001）（图10C）。

11、MHD和MHD-D减轻了DN或HG诱导的PI3K/AKT/mTOR通路在DN小鼠肾脏和MPC5细胞中的激活（图11A-B）。

此外，精脒处理也减弱了这些通路的激活（图11C-D）。重要的是，当通过PI3K抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT/mTOR信号时，MHD、MHD-D和精脒对自噬的影响被抵消（图11E-F）。

糖尿病肾病（DN）是糖尿病最严重和致命的并发症之一，可能导致需要透析或肾移植的终末期肾病。目前的治疗策略主要集中在症状管理上，如控制高血糖、高血压和蛋白尿，但这些方法不足以阻止DN的进展，使得DN的管理具有挑战性。越来越多的研究表明，中医药（TCM）在DN治疗中具有独特的优势。在此，我们发现MHD通过不同的机制保护DN小鼠的肾功能。首先，MHD可能通过激活足细胞自噬直接保护肾功能，从而减轻肾脏炎症和纤维化。其次，MHD导致肠道菌群组成和微生物代谢物（尤其是精脒）的有益变化，而精脒有助于激活足细胞自噬。我们认为，这两条途径可能共同促进MHD的治疗效果，其中细胞信号介导的直接肾脏效应和肠道菌群调节影响全身代谢和炎症反应（图12）。我们的发现为中医药管理DN提供了新的见解，并为MHD在未来DN治疗中的应用提供了理论依据。

MHD在临床实践中已应用三十多年，在各种疾病中显示出良好的效果。在此，我们发现MHD治疗改善了DN小鼠的代谢紊乱、胰岛素抵抗和慢性炎症。重要的是，MHD通过激活足细胞自噬和调节肠道菌群及其相关代谢物，减轻了糖尿病的常见并发症DN的症状。有趣的是，MHD和MHD-D在改善DN方面表现出更显著的效果，而达格列净（DSR）的效果则较小。这种差异可能归因于DSR在配方中的比例极小，仅为2.5%，只能在增加疗效方面发挥补充作用，而非直接发挥抗炎和免疫调节功能。此外，在MHD和MHD-D的表型效应中未观察到统计学上的显著差异，主要差异在于微生物组成。这一发现可能是因为DSR的主要活性成分prim-o-glucosylcimifugin被认为对修复肠道免疫屏障、调节肠道环境中微生物的丰度以及改善肠道菌群的组成具有显著的调节作用。然而，我们仅通过LC‒MS分析初步鉴定了MHD的活性成分，尚未确定可能有助于MHD在本研究中肾脏保护作用的具体生物活性物质。未来的研究可以利用网络药理学技术预测MHD中的关键活性成分，并通过分子对接验证这些预测活性成分对关键靶点的结合亲和力，以提供更多关于MHD作用和机制的详细信息。

胰岛素抵抗和代谢紊乱是促进DN进展的重要因素。在DN患者中，胰岛素抵抗阻碍了血糖的有效摄取和利用，而长期高血糖又会诱导脂质代谢紊乱。我们发现，MHD治疗增强了DN小鼠的胰岛素信号通路，并改善了肝脏和eWAT中改变的脂质代谢。这一结果可能是因为MHD中黄芪的关键活性成分（如黄芪苷II和黄酮）可能增加胰岛素与其受体的结合并提高受体活性，从而实现胰岛素信号的有效下游传递。随后，AKT磷酸化的调节激活了胰岛素信号通路，促进葡萄糖代谢并降低血糖水平。此外，黄芪苷II和黄酮可以促进脂肪酸氧化，抑制脂肪酸在体内的积累，从而调节脂质代谢。黄芪调节糖脂代谢的精确机制尚不清楚。有趣的是，在MHD治疗后，ACC和CPT-1α的表达水平显著降低。因此，我们假设MHD可能通过AMPK/ACC/CPT-1α途径（一条著名的脂质代谢途径）发挥作用，这有待进一步研究。

炎症和纤维化在糖尿病肾损伤的进展中起着关键的加速作用。大量研究明确表明，炎症贯穿于DN的发展过程中，并对导致肾脏损伤至关重要。DN小鼠的肾功能受损，炎性细胞因子（如TNF-α和IL-1β）可以增加TGF-β的表达，进而促进肾脏纤维化的进展。在本研究中，除了减轻肝脏、脂肪组织和结肠的炎症外，MHD治疗还显著减轻了肾脏的炎症和纤维化。MHD的这些抗炎和抗纤维化作用可以归因于其主要活性成分。例如，来自黄芪的黄芪苷II、黄酮、染料木素和毛蕊异黄酮；来自当归的meranzin hydrate；以及来自DSR的cimicifugoside、5-O-甲基维萨米奥醇和二氢香豆素。这些成分降低了与炎症和纤维化相关的因子的表达。此外，这些成分可能直接阻碍IκB激酶（IKK）的活性，阻止IκB的磷酸化和随后的降解，确保NF-κB不会转移到细胞核以启动炎性基因的转录，从而最终缓解糖尿病引起的肾脏损伤。

肠道‒肾脏轴引起了越来越多的关注。在DN患者中，肠道菌群发生了显著变化，有益菌的丰度减少，有害菌的丰度增加。这种失衡导致紧密连接和粘附蛋白的表达减少，最终导致肠道屏障的破坏。受损的肠道屏障可以促进细胞移位和感染。这一过程反过来通过肠道内毒素和细菌素触发促炎细胞因子的释放，从而加剧DN的进展。我们的研究表明，MHD治疗保护了肠道屏障并减轻了DN小鼠的结肠炎症。研究表明，来自黄芪的多糖可以为肠道粘膜的修复提供营养支持，调节肠道粘膜细胞的增殖和凋亡信号，增加粘膜细胞中紧密连接蛋白的表达，最终增强肠道屏障功能。此外，僵蚕、蝉蜕、当归和DSR等成分可以通过抑制NF-κB通路的活性或调节免疫反应来减轻肠道炎症。这些生物活性化合物和成分的保护作用可能有助于MHD增强肠道屏障功能。

肠道菌群在DN的进展中起着关键作用，我们通过全长16S rRNA分析鉴定了四种与小鼠肾脏损伤指标显著相关的细菌种类。其中，Akkermansia muciniphila作为一种公认的有益菌，具有最高的丰度，并已被证明可以显著改善肥胖、1型和2型糖尿病、脂肪肝、肠道炎症和各种癌症等状况。DN小鼠中Akkermansia muciniphila的丰度显著降低，而在MHD治疗后显著增加，表明MHD的保护作用可能至少部分由这种有益菌介导。尽管文献中尚未明确定义其他三种细菌的具体作用，但我们的分析显示，Clostridium cuniculi和Desulfovibrio sp011039085与肾脏损伤指标水平呈负相关，与肠道菌群代谢物精脒和亚精胺呈正相关，而Jeotgalibaca ciconiae则呈现相反的相关模式。因此，我们假设Clostridium cuniculi和Desulfovibrio sp011039085可能作为有益菌，有助于改善DN，而Jeotgalibaca ciconiae丰度的增加可能会加剧肾脏损伤。未来实验应精心设计以验证这一假设。我们的结果表明，MHD可能通过DN小鼠的肠道‒肾脏轴发挥其作用，但在人类和小鼠之间，肠道菌群的组成和功能以及饮食习惯存在显著差异。因此，在小鼠模型中有效的治疗在人类中可能不一定产生相同的结果，我们的发现不能直接应用于临床实验。通过在小鼠中进行额外的菌群移植实验，可以揭示MHD作用与菌群之间的因果关系。未来的临床研究可以通过分析接受MHD治疗的患者的粪便样本，验证这些结果，为这种治疗方法的临床相关性提供更多见解。

通过代谢物分析，我们筛选出四种可能与MHD作用相关的代谢物。具体来说，L-谷氨酸是谷胱甘肽合成的前体，这是一种重要的抗氧化剂，能够清除体内的自由基和氧化应激产物。因此，L-谷氨酸可能通过增强抗氧化能力来减少氧化应激对肾小管细胞和肾小管间质的损伤，从而改善DN。研究表明，GABA可能通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，促进β细胞增殖以改善胰岛素抵抗和葡萄糖耐受，并发挥抗炎作用，从而改善DN。大肠杆菌、拟杆菌、梭菌等属可以参与多胺代谢中的酶促反应，并编码相关酶以促进多胺（如精脒和亚精胺）之间的转化。精脒和亚精胺也被认为是自噬激活剂，这些多胺可能通过激活自噬来减轻DN。同样，我们的体外实验证实了精脒对足细胞的自噬促进作用。这些结果表明，MHD对DN的治疗效果可能与肠道菌群及其相关代谢物的修饰有关。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是自噬的重要机制之一。AKT活性受到多种上游信号通路的影响，包括胰岛素、胰岛素样生长因子（IGF）、生长因子和细胞外信号。然而，不同受体或通路的激活可能导致不同器官中AKT活性的趋势相反。这是因为，在肝脏和脂肪组织中，AKT的主要功能是调节糖代谢和脂质合成。AKT活性的降低表明胰岛素信号通路被抑制，导致肝脏葡萄糖摄取减少和脂肪细胞中过度积累。相比之下，在肾脏中，DN早期AKT的激活可能发挥保护作用，而长期过度激活AKT可能促进肾脏炎症和纤维化，从而加速肾衰竭。在我们的研究中，DN小鼠肾脏中AKT与下游mTOR信号通路一同被过度激活，导致自噬受到抑制。MHD本身和微生物代谢物精脒通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路激活足细胞自噬，这些效应在PI3K信号被抑制后被抵消，突显了这一通路在MHD介导的肾脏保护作用中的参与。

除了PI3K/AKT/mTOR通路外，其他通路也可能对MHD的作用和机制有所贡献。例如，黄芪可以通过AMPK通路降低血糖，毛蕊异黄酮可以通过Nrf2/HO-1通路介导抗氧化反应，而prim-o-glucosylcimifugin可能通过NF-κB通路调节炎症过程。尽管我们的发现没有直接证据表明它们的参与，但我们认为未来的研究必须调查这些通路，以更全面地了解MHD的作用机制。

目前DN的治疗格局主要分为两大方法，即中医药和西药。西药通常依赖SGLT2抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂等药物来管理DN。然而，这些治疗也可能引发严重的副作用，如咳嗽、血管性水肿和急性肾损伤。此外，尽管西药对管理DN至关重要，但通常无法完全阻止疾病的进展。相比之下，中医药通过辨证论治和多靶点干预，通过改善患者的症状和整体健康状况提供更全面的方法。目前，临床上可用的中医药处方包括黄连解毒汤、肾气丸和当归补血汤。与这些中医药相比，MHD作为一种更平衡的草药组合，具有其自身的优势，如祛风、清动脉、调节免疫和改善微循环。本研究强调了MHD在治疗DN中的独特优势，即其对多种机制的多靶点效应，可以通过多种方式保护肾脏并延缓疾病进展。一般来说，MHD是耐受性良好的，由于其主要成分黄芪，可能会出现轻度胃肠道不适或过敏反应等罕见副作用。这些副作用虽然不常见，但突显了进一步优化治疗策略的必要性。将MHD与西药结合可能可以利用这两种方法的优势，从而开发出更有效的DN治疗方法。