卡介苗（BCG）是一种牛分枝杆菌减毒活菌株，是唯一获批的结核病疫苗。自 1920年代以来，卡介苗已接种超过 40 亿剂。卡介苗预防儿童感染结核分枝杆菌的免疫保护效力可达80%以上，然而，在青少年和成人中，其免疫保护效力极其不稳定，变化范围为 0% 到 80% 之间。目前，大约有 20 亿人潜伏感染结核分枝杆菌（LTBI）。卡介苗无法避免潜伏感染的结核分枝杆菌被再次激活，加上缺乏彻底从体内清除结核菌的抗生素以及结核耐药株不断涌现，使得结核病的预防和控制变得日益严峻。在过去三十年中，人们致力于开发比卡介苗免疫保护效果更佳的结核疫苗，可惜尚未成功。
复旦大学生命科学院张鹭、多伦多大学分子遗传学系刘军、上海市公共卫生临床中心结核病研究中心晏博、斯微生物李航文等人在
Molecular Therapy: Nucleic
Acids发表文章：AnmRNA vaccine induces antimycobacterial immunity by activating DNA damage repair and autophagy.
他们开发了一种编码谷氨酰胺合成酶（GlnA1）和分枝杆菌噬菌体裂解酶LysB融合抗原的L3T mRNA结核分枝杆菌疫苗，以斯微生物开发的TPP作为递送系统，在斑马鱼结核病模型中表现出显著的预防和治疗活性。
L3T mRNA疫苗免疫斑马鱼使得涉及DNA损伤修复的多个途径被激活，并且，在肉芽肿中诱导细胞自噬，从而降低斑马鱼体内的细菌负荷，延长生存时间，还表现出一定的杀菌治疗效果。总的来说，这项研究表明 mRNA 疫苗可引发有效的先天免疫和适应性免疫，为宿主提供有效的保护来抵御分枝杆菌的攻击。
01
L3T结核mRNA疫苗的设计构造
谷氨酰胺合成酶（GlnA1）是结核分枝杆菌的必需酶，在氮代谢中发挥核心作用。此外，GlnA1也是结核分枝杆菌的毒力因子及潜在的药物靶点。LysB是分枝杆菌噬菌体分泌的一种溶菌素，抑制多种分枝杆菌生长，促进裂解，包括结核分枝杆菌（ M. tb ）和海洋分枝杆菌（M. marinum）。研究人员设计结核分枝杆菌mRNA疫苗编码一种融合抗原：由GlnA1、LysB及两者之间9个氨基酸组成的Linker构成。经过序列优化的最终mRNA称为L3T mRNA，其中5'UTR序列来自非洲爪蟾β-珠蛋白基因，而3'UTR序列来自人α珠蛋白基因。L3T mRNA结核疫苗采用斯微生物开发的LPP作为递送载体。LPP递送系统通过带负电的mRNA和带正电的聚合物混合形成一种致密的核，再包裹脂质双层形成类似于病毒颗粒样的核-壳结构。
02
结核L3T mRNA增加先天免疫细胞的募集
疫苗成功接种起始于天然免疫系统的局部激活。肌肉注射后，局部驻留细胞分泌的促炎细胞因子和趋化因子将先天免疫细胞（包括巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞）募集到注射部位。接着，抗原被免疫细胞吸收并运输到引流淋巴结以激活适应性免疫反应。
研究人员发现，在转基因斑马鱼幼虫（其体内的巨噬细胞和中性粒细胞分别表达红色荧光蛋白和 DsRed）注射3ug L3T mRNA-LPP 4h后，注射部位中性粒细胞和巨噬细胞的募集增加，其中中性粒细胞募集更为明显，而且，免疫细胞的募集至少要持续至注射后24h。此外，注射3ug L3T mRNA 的斑马鱼幼虫至少可存活10天。
03
结核疫苗L3T mRNA的免疫保护效果
研究人员使用L3T mRNA-LPP、阴性对照（PBS、LPP及pcDNA）及Ag85A mRNA-LPP（称为Ag85T）、BCG及L3 DNA疫苗（pcDNA-L3）两次免疫成年斑马鱼（间隔2周）。第二次免疫后4周，使用M. marinum 535（海分枝杆菌）攻毒。与阴性对照组、编码Ag85A抗原的mRNA疫苗及编码相同抗原的DNA疫苗相比，L3TmRNA-LPP显然拥有更高的生存率。有意思的是，尽管L3T DNA疫苗的免疫剂量（6μg）高于L3T mRNA疫苗的免疫剂量（3μg），但是，L3T mRNA疫苗免疫保护效果更好。
在攻毒试验后3周，处死疫苗免疫过的斑马鱼，进行细菌负荷和组织学分析。L3TmRNA免疫斑马鱼体内的细菌负荷要比其他免疫组降低约2个log。肉芽肿是结核病病理学的一个标志，代表宿主获得感染和宿主免疫反应的诱导。虽然肉芽肿通过限制病原体使宿主受益，但它们也是细菌传播的生态位，最终的结果取决于细菌毒力和宿主免疫之间的相互作用。在未免疫的斑马鱼 （阴性对照组 PBS 、 LPP 和 pcDNA） 中，在肝脏、肾脏、脾脏、肠道和睾丸等多个器官中检测到大量肉芽肿。这些肉芽肿在大小、坏死中心的外观和坏死程度上是异质性的。值得注意的是，这些肉芽肿中的许多表现为成簇，表明细菌在同一区域广泛传播，随着细菌扩散到邻近区域，会出现新的肉芽肿。L3TmRNA疫苗免疫的斑马鱼体内肉芽肿数量较少（＜20个），相反，其他对照组检测到的肉芽肿数量为20-90个。在坏死性肉芽肿中检测到大量细菌，尤其是那些有干酪性坏死的肉芽肿。因此，坏死性肉芽肿的数量与细菌负荷大致相关。
L3T 免疫斑马鱼体内的肉芽肿往往是孤立的，而就像在其他组 （PBS、LPP、pcDNA 和 pcDNA-L3） 中观察到的聚集在一起。有趣的是，L3T和Ag85T免疫组中的一些肉芽肿似乎要健康得多：非坏死性且位置独立；检测不到细菌。这说明这项肉芽肿的不可能是由于细菌传播而新形成的，相反，这些肉芽肿可能已经成功解决了感染并正在恢复。
04
结核疫苗L3T mRNA的治疗效果
斑马鱼幼虫感染海分枝杆菌24后，与阴性对照相比（注射PBS或者LPP），注射L3TmRNA，在第2天和第三天可将细菌负荷分别减少1.9倍和2.7倍，延长存活时间。在成年斑马鱼感染海分枝杆菌的第14天和第17天，分别注射两次L3TmRNA，使得成年斑马鱼存活时间得到明显延长，体内细菌负荷减少1个log，肉芽肿数量发生显著减少。
使用三种不同的海分枝杆菌感染斑马鱼，包括海分枝杆菌1218R，灭活1218菌株(whiB4:Tn) 及耐药菌株M. marinum 535。与阴性对照组（PBS/LPP）相比，L3TmRNA疫苗注射组，斑马鱼体内细菌负荷明显减少。让人感到惊讶的是，L3T mRNA疫苗注射组（感染后注射两次）与利福平注射组（感染后治疗持续一周）体内的细菌负荷接近，这说明L3TmRNA疫苗有着非凡的杀菌效果。有趣的是，利福平与L3T mRNA疫苗无叠加或者协同效应，而且，对于耐药菌株M.marinum535来说，L3TmRNA疫苗显示出更强的杀菌效果。
05
结核疫苗L3T mRNA疫苗诱导DNA损伤修复
斑马鱼没有淋巴结，肾脏脏和脾脏是斑马鱼的主要淋巴器官，负责清除外来物质和有缺陷的血细胞。研究人员从分别注射L3T mRNA 疫苗和LPP的斑马鱼体内分离出肾脏细胞进行RNA-seq分析。结果发现，与LPP对照相比，在L3TmRNA疫苗的斑马鱼中共检测到302个差异表达基因，包括 111 个上调基因和 191 个下调基因。上调基因很多与DNA损伤修复和复制相关，包括Dna2、Fen1、Msh2、Mcm9、PcnA、Pold3、Pms2、Ssrp1a、Spata18和Yars1。
MSH2和PMS2是DNA错配修复系统的重要组成部分。PCNA 不仅在错配识别步骤中起着重要作用，而且在随后的 DNA 合成中也起着重要作用。Pold3 基因编码 DNA 聚合酶的 66-kDa 亚基δ并调节其活性。双链断裂（DSB）对于细胞有害，细胞通过两条主要途径—同源重组HR和非同源末端连接NHEJ来修复DSB。MCM9 和 DNA2涉及DSB修复过程。单链断裂（SSB）通常是由 DNA 的氧化损伤产生的，PARP1和Fen1参与此过程。SSRP1a 和 SPT16 形成促进染色质转录复合物，它充当组蛋白伴侣，作为染色质修复系统的一部分。SPATA18是一种p53诱导蛋白，可诱导线粒体内的溶酶体样细胞器，从而有助于线粒体质量控制。
DNA损伤修复对于维持基因组稳定性至关重要。在淋巴细胞发育过程中发生的故意 DNA 断裂和重排，例如V（D）J重组、类别转换DNA重组及体细胞超突变，对于产生能够识别广泛抗原的多种免疫受体和抗体至关重要。参与DNA断裂和修复的酶缺乏可导致免疫缺陷，例如，RAG1和RAG2产生 DNA双键断裂以启动 V（D）J 重组。RAG1或RAG2缺陷小鼠表现出严重的联合免疫缺陷表型，缺乏成熟的B细胞和T细胞.。此外，缺乏 Psm2 或 Msh2 的小鼠表现刺激有限的 B 细胞库，并且在免疫红蛋白重链上几乎没有体细胞突变，这表明错配修复系统有助于体细胞超突变，而不是抑制效应。
在L3TmRNA免疫的斑马鱼中观察到多个DNA修复系统被激活，这表明RNA-seq分析已经捕捉到了适应性免疫正常发育中B细胞亲和成熟和T细胞激活过程的快照。与此相对应的是，编码免疫球蛋白（Igs）或者Ig类似结构域蛋白的基因发生显著富集。此外，CD44基因同样在L3T mRNA免疫的斑马鱼中发生上调。斑马鱼的CD44a基因在T细胞受体（TCR）激活后不久上调，并在效应细胞和免疫反应消退后存活成为记忆细胞的细胞上保持表达。
内肽酶在抗原加工过程中起着重要作用。内肽酶通过将蛋白质降解成多肽片段，这些片段可以被进一步加工并与MHC分子结合。在L3TmRNA免疫的斑马鱼中，参与内肽酶抑制剂活性和内肽酶活性负调节的基因显著下调，表明抗原降解和加工发生显著增加。
总的来说，这些结果表明L3T mRNA免疫激活了经典的DNA损伤修复过程，促进适应性免疫的诱导，包括抗原特异性抗体和T细胞的产生。
06
结核疫苗L3T mRNA疫苗引发自噬
有研究表明，尽管发生于不同的细胞区室内，DNA损伤修复和自噬可能在机制上相关，例如，错配修复系统的MSH2和MSH6充当5-氟尿嘧啶诱导的DNA损伤的感受器；碱基切除系统的APN-1和EXO3作用于DNA修复的后续步骤，并激活自噬；SPATA18是一种有助于线粒体质量控制的蛋白质，是激活线粒体自噬所必需的。研究人员观察到L3T mRNA疫苗免疫斑马鱼MSH2、PMS2、SPATA18和组织蛋白酶S（溶酶体中的一种主要蛋白酶）基因表达水平上升，因此，他们对免疫斑马鱼体内的自噬做更仔细的检测。
LC3是是一种泛素样蛋白，在自噬体形成中起关键作用。LC3B 是 LC3 的一种同工型，而 p62 经常用作疾病条件下临床样本中自噬的标志物。免疫染色在L3T免疫的斑马鱼的肉芽肿中检测到LC3B的强烈信号。与自噬的促生存作用一致，LC3B 在非坏死性肉芽肿中检测到最强烈和广泛（左A），并且仅在坏死性肉芽肿的外周检测到（左B和C）。有趣的是，甚至在伴有干酪性坏死的肉芽肿中检测到 LC3B 的阳性染色，尽管水平较低（左D）。重要的是，无论坏死程度如何，对照组（PBS和LPP）中的任何肉芽肿都没有检测到LC3B呈阳性（左E和F）。
另外一方面，免疫染色在50%的L3T免疫斑马鱼的肉芽肿中检测到p62染色呈阳性。在 L3T 免疫的斑马鱼中，具有强 p62 信号的巨噬细胞正在积极吞噬并靶向细菌进行自噬降解（右C，箭头）。这些巨噬细胞可能在消除入侵病原体方面起关键作用。随着细菌种群的减少，需要表达高水平 p62 的巨噬细胞减少(右D)。并且在已完全清除细菌的肉芽肿中，p62 被降解并且不再检测到（右E）。在对照组中，即使在含有大量细菌的肉芽肿中，也仅检测
到p62的微弱和弥漫信号（右F和G）。
在L3T免疫组中，未与细菌直接接触的巨噬细胞中未检测到p62信号。这表明 p62 表达的诱导是细菌依赖性的。然而，阴性对照组的肉芽肿中的巨噬细胞虽然接触细菌，仍然表现出缺乏p62信号，也表明细菌本身不足以驱动 p62 表达，需要通过L3T免疫进行引发。
总的来说，这些结果表明L3T mRNA疫苗成功诱导先天免疫机制和适应性免疫机制，从而有效控制细菌感染。
07
结核疫苗L3T mRNA的治疗活性由DNA损伤修复介导
利用RNA-seq 技术分析感染海分枝杆菌后L3T免疫的斑马鱼肾脏细胞，研究人员比较阴性对照组（PBS注射组）和L3T治疗组在感染后第14天和第24天的基因表达情况，结果发现，细菌感染引起的免疫反应和炎症在很大程度上不受随后的mRNA疫苗治疗的影响。
有意思的是，与感染后第14天相比，感染后第24天的阴性对照斑马鱼体内涉及DNA复制和修复的基因中有52个发生下调，仅有2个基因发生上调。相反，L3T治疗组中，只有4个基因在DNA复制和修复类别中下调，1个基因上调，表明L3T治疗能够抵消M. marinum感染诱导的DNA复制和修复的下调。
综上所述，这些数据表明，在疾病自然进展过程中，细菌感染引起的炎症会诱导DNA损伤。然而，海分枝杆菌抑制了宿主DNA损伤修复和复制系统，这导致了斑马鱼的死亡。相比之下，L3T处理激活了宿主DNA损伤修复和复制系统，并在很大程度上中和了病原体的负面影响，从而延长了斑马鱼的存活时间。
08
结语
这项研究开发的L3T mRNA结核疫苗可诱导巨噬细胞自噬以及 B 细胞和 T 细胞免疫，并显示出卓越的预防和治疗活性，强调了引发先天免疫和适应性免疫以控制分枝杆菌感染的重要性。
胞质溶胶中合成的L3T抗原激活了泛素-蛋白酶体系统（UPS），该系统降解抗原，降解的抗原肽被转移到内质网，结合MHC I 类进行抗原呈递。激活的UPS还介导胞质海分枝杆菌泛素化，然后被p62靶向进行自噬降解。支持这一点的是，编码具有预测的泛素连接酶或转移酶活性蛋白质的几个基因在 L3T 免疫斑马鱼中上调，包括含有 RING 结构域的 E3 连接酶 Trim35-7、Rnf26 和 Rnf122。
在淋巴细胞抗原受体基因的组装和多样化期间，在V（D）J 重组过程中，包括 B 细胞的免疫红蛋白重链基因和轻链 κ 和 λ 基因，以及 TCR-β、-α、-γ 和 -δ 链基因，适应性免疫细胞中发生程序化 DNA DSBs和重排。体细胞超突变以极高的速率（每次细胞分裂每个碱基对 ∼10-3 个突变）在免疫球蛋白基因的可变区引入非模板化点突变，这个过程驱动亲和力成熟，从而导致表达对其同源抗原具有高亲和力的免疫球蛋白的 B 细胞扩增。这些刻意的 DNA 断裂和重排对于正常的淋巴细胞发育至关重要。因此，参与经典DNA修复系统的多个基因（包括错配修复以及DSB和SSB修复）在L3T mRNA免疫斑马鱼中富集和上调可以认为是成功诱导B细胞和T细胞免疫的证据。
尤其值得关注的是，L3T mRNA疫苗显示出非常有效的杀菌活性，在感染后注射L3T mRNA疫苗的杀菌效果超过了一线抗生素利福平。据目前所知，以前从未对结核病疫苗描述过这种杀菌效果。一种可能的解释是 L3T mRNA 编码的溶血素B有助于细菌杀伤。然而，随着mRNA转录水平迅速下降并在注射后72小时达到背景水平， 赖素B蛋白在细菌杀伤中的作用受到限制。因此，未来应该聚焦提升L3TmRNA疫苗的稳定性和丰度，尝试采用circRNA或者saRNA疫苗平台，加强其杀菌效果。
参考文献
[1] Chen D, Huang W, Shen L, Zhang J, Pan Z, Zhang C, Tang Y, Zhou Z, Tao J, Luo G, Zhang S, Zhou J, Xu S, Zhang M, Li Y, Fang Y, Zhao F, Huang L, Li H, Yang H, Lv H, Sha W, Yan B, Liu J, Zhang L. An mRNA vaccine induces antimycobacterial immunity by activating DNA damage repair and autophagy. Mol Ther Nucleic Acids. 2024 Nov 26;36(1):102402. doi: 10.1016/j.omtn.2024.102402.
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撰写| 工程菌星球
校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea
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