中文摘要
目的验证无酚红M199培养基的贮存效期，同时探索无酚红M199效期对无酚红Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated Sabin strain poliovirus vaccine，sIPV）关键质量属性的影响。
方法对贮存0、6、12、18、24、30、36及42个月的3批次无酚红M199干粉培养基进行外观、澄清度、pH、干燥失重、细菌内毒素、微生物限度等物理化学性质及微生物性质长期监测；检测用贮存36个月并检定合格的无酚红M199制备的sIPV成品关键质量属性；将近效期和远效期无酚红M199制备的各3批sIPV分别贮存于37 ℃和25 ℃进行稳定性监测，检测D抗原含量，评价其稳定性；用2组sIPV免疫大鼠，检测大鼠血清抗体效价，评价其免疫原性。
结果无酚红M199干粉培养基于2~8 ℃贮存42个月后的外观、澄清度、pH、干燥失重、细菌内毒素、微生物限度等均合格；用贮存36个月无酚红M199所制备sIPV成品的pH、D抗原、蛋白含量、Vero细胞DNA残留量、牛血清白蛋白残留量、Vero细胞蛋白残留量、游离甲醛含量等各项检定结果均符合中国药典2020年版三部和企业标准要求；用贮存36个月无酚红M199制备的sIPV效价合格、稳定性良好且与远效期无酚红sIPV免疫原性趋势一致，效力（t =-0.15~2.17，P＞0.05）和诱导中和抗体水平（t =-1.46~2.02，P＞0.05）差异均无统计学意义。
结论用贮存至36个月的无酚红M199制备的sIPV成品稳定性较好，近效期和远效期无酚红M199制备的sIPV产品质量属性、免疫原性及稳定性趋势一致，且对产品质量无影响，无酚红培养基的效期初步可定为36个月。
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正文
Sabin株脊髓灰质炎（脊灰）灭活疫苗（Sabin strain inactivated poliomyelitis vaccine，sIPV）是目前预防脊灰最安全有效的疫苗，多年临床研究数据表明其具备良好的安全性和免疫原性。M199培养基是sIPV生产过程中的关键物料，用于细胞传代培养、半成品配制等工艺过程，在制剂阶段起重要的稳定剂和保护剂作用，其质量属性及效期等对疫苗产品质量有重要的影响。M199培养基一般添加酚红作为酸碱指示剂，而酚红为疫苗非目标成分。近年来，对疫苗终产品中杂质和防腐剂的规定越来越严格，用无酚红培养基代替有酚红培养基成为业界共识。然而，用无酚红M199培养基生产sIPV时，其效期及无酚红sIPV成品的质量属性均需验证。本研究通过验证3批无酚红M199的贮存效期，比较用远效期及近效期无酚红M199制备的sIPV的质量属性、稳定性及免疫原性，综合评价无酚红M199的质量属性，明确无酚红M199培养基效期对产品质量的影响，为研究无酚红培养基的贮存效期以及无酚红sIPV成品质量属性提供初步依据。
1
材料与方法
1.1
主要试剂
无酚红M199培养基（Rf1：Gibco批号2299574、Rf2：Gibco批号2299576、Rf3：Gibco批号2286073）购自美国Gibco公司；sIPV Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原含量测定试剂盒，Vero细胞残余蛋白检测试剂盒，Ⅱ型脊灰疫苗病毒滴定质控品来自北京生物制品研究所有限责任公司（北京公司）；细菌内毒素工作标准品购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司；Vero细胞DNA工作参考品、Hep-2细胞、蛋白含量测定国家标准品（非人用）及Ⅰ、Ⅲ型脊灰疫苗病毒滴定国家参考品购自中国食品药品检定研究院。
1.2
实验动物
无特定病原体级Wistar大鼠，410只，雌雄各半，体质量170~200 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物饲养许可证号：SYXK（京）2020-0031。
1.3
无酚红M199干粉培养基的长期稳定性物理化学（理化）性质及微生物指标监测
将Rf1、Rf2、Rf3无酚红M199干粉培养基贮存于2~8 ℃，于0、6、12、18、24、30、36及42个月时取样，按照中国药典2020年版三部（药典三部）要求以及培养基质量企业标准（企标）检定，检测外观、澄清度、pH、干燥失重、细菌内毒素、微生物限度等项目。
1.4
sIPV原液及成品制备
sIPV单价原液由北京公司经病毒培养、收获、浓缩纯化及灭活等工艺制备。分别将远效期和近效期（贮存36个月并检定合格）的Rf1、Rf2、Rf3无酚红M199干粉培养基按比例溶解配制成无酚红M199溶液，取各型别sIPV单价原液超滤离心（1 958×g离心5 min），分别加入Rf1、Rf2、Rf3无酚红M199溶液，反复3次，置换成无酚红sIPV单价原液，然后按比例配制成无酚红sIPV成品。远效期无酚红制备sIPV批号为M1—M3，近效期批号为A1—A3。
1.5
近效期无酚红sIPV成品稳定性考察
1.5.1 37 ℃加速稳定性将A1—A3批无酚红sIPV成品取样贮存于37 ℃条件下，第0、3、7、14、21、28天检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原含量，与无酚红sIPV成品历史批次（批号：B1—B3）数据比较，分析2组成品稳定性趋势。
1.5.2 25 ℃长期稳定性将A1—A3批无酚红sIPV成品取样贮存于25 ℃条件下，第0、2、4、6、8、10、12周检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原含量，与B1—B3批数据比较，分析2组成品稳定性趋势。
1.5.3 D抗原含量按照药典三部通则3429相关要求，采用ELISA检测各时间点的sIPV关键指标D抗原含量。将系列稀释10、20、40、80、160、320倍的标准品和稀释适宜浓度的供试品，与包被抗体于37 ℃反应1 h后，洗板，加入检测抗体。按照常规ELISA步骤操作，反应结束后加入底物显色终止，测定吸光度（A450/630）值，用系列稀释的标准品D抗原浓度及其对应的A450/630值作标准曲线，计算供试品D抗原含量。以时间为横坐标，检测值为纵坐标，绘制D抗原趋势图。
1.6
近效期无酚红sIPV成品和历史成品批次各项指标检测比较
分别对A1—A3和B1—B3批无酚红sIPV成品，按照药典三部以及注册企标要求检测pH、D抗原、蛋白质含量、Vero细胞DNA残留量、牛血清白蛋白残留量、Vero细胞蛋白残留量、游离甲醛含量。
1.7
远效期和近效期无酚红sIPV成品免疫效果评价
1.7.1 效力检测按照药典三部通则3534相关要求，将M1—M3和A1—A3批无酚红sIPV成品（供试品）与参考疫苗（经全项检定合格并经标定使用）进行1、3、9、27倍系列稀释后，经后腿肌内注射，分别免疫Wister大鼠（雌雄各半），每个稀释度10只，0.5 mL/只。第21天经眼球采全血，5 000×g离心10 min，分离收集血清，于56 ℃灭活30 min。检测大鼠血清中针对各型脊灰病毒的中和抗体并分别计算其半数有效剂量（median effective dose，ED50），计算供试品各型别的相对效力。供试品各型别ED50应不低于参考品。
1.7.2 中和抗体检测分别用M1—M3和A1—A3批无酚红sIPV成品免疫大鼠，每组10只。分别于第0、21、42天共进行3次免疫，每次肌内注射0.5 mL/只。第21、42天和第3次免疫后21 d（第63天）经眼眶采全血，5 000×g离心10 min，分离收集血清。采用微量细胞病变法测定大鼠中和抗体水平。将待检血清1∶4稀释，于56 ℃灭活30 min，在96孔细胞板中加入待检血清，2倍系列稀释到所需稀释度，每份血清同时平行接种2孔，分别加入sIPV Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型稀释成2 000 CCID50/mL攻击用病毒，同型血清加入同型病毒液，每孔0.05 mL。混匀后于35 ℃ 5% CO2培养箱中和3 h，接种（1.0~2.5）×105 mL-1的细胞悬液0.1 mL，混匀后置于35 ℃ 5% CO2培养箱，7 d判定结果。以病毒回滴结果在640~6 400 CCID50/mL时试验成立。孔内细胞完全病变记作阳性，无病变记作阴性，以Karber法计算中和终点，即能保护50%细胞不受100 CCID50/0.05 mL攻击病毒感染的血清最高稀释度为该血清的抗体滴度。中和抗体效价≥1∶4为阳性，＜1∶4为阴性。
1.8
统计学分析
采用Excel 2013软件进行t检验，比较A1—A3批与B1—B3批sIPV中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒D抗原含量，A1—A3与M1—M3批sIPV免疫Wistar大鼠的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型血清中和抗体几何平均滴度（geometric mean titer，GMT）水平，以及A1—A3批与B1—B3批sIPV中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒D抗原含量的稳定性数据，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2
结果
2.1
无酚红干粉培养基长期理化性质监测
结果显示，无酚红干粉培养基Rf1—Rf3贮存于2~8 ℃至42个月，定性结果指标外观为类白色固体粉末，澄清度为溶液澄清。贮存不同时间的培养基pH均在4.4~4.8，干燥失重不高于5%，细菌内毒素不高于10 内毒素单位（endotoxin unit，EU）/mL，需氧菌总数不高于200 CFU/g，霉菌及酵母菌总数不高于50 CFU/g，均符合药典三部相关要求及原辅料企标。定量指标结果见表1。
2.2
近效期无酚红sIPV成品稳定性评价
2.2.1 37 ℃加速稳定性贮存在37 ℃条件下，A1—A3批sIPV中Ⅰ型D抗原含量在7 d内不低于12 D抗原单位（D antigen unit，DU）/剂，Ⅱ型D抗原含量在28 d内不低于36 DU/剂，Ⅲ型D抗原含量在28 d内不低于32 DU/剂，符合药典三部和企标要求。A1—A3与B1—B3批sIPV的Ⅰ型D抗原含量降解趋势线斜率均值分别为-1.733和-1.419，Ⅱ型分别为-1.781和-1.391，Ⅲ型分别为-2.229和-2.390，各型37 ℃加速稳定性变化差异均无统计学意义（t值分别为-1.65、-2.22、0.54，P值分别为0.173、0.091、0.615），加速稳定性趋势一致（图1）。
2.2.2 25 ℃长期稳定性室温条件下，A1—A3批sIPV中Ⅰ型D抗原含量在8周内不低于12 DU/剂，Ⅱ型D抗原含量在12周内不低于36 DU/剂，Ⅲ型D抗原含量在12周内不低于32 DU/剂，符合药典三部和企标要求。A1—A3批与B1—B3批sIPV的Ⅰ型D抗原含量降解趋势线斜率均值分别为-1.179和-0.893，Ⅱ型分别为-1.131和-1.000，Ⅲ型分别为-1.869和-1.917，各型室温稳定性变化差异均无统计学意义（t值分别为-1.43、-0.65、0.26，P值分别为0.226、0.551、0.811），长期稳定性趋势一致（图2）。
2.3
近效期无酚红sIPV成品质量属性
2.3.1 D抗原含量A1、A2、A3批sIPV的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原平均含量分别为16、46、47 DU/剂，B1、B2、B3批sIPV分别为15、45、47 DU/剂。经t检验分析，2组样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原平均含量差异均无统计学意义（t值分别为2.12、1.06、0.38，P值分别为0.101、0.349、0.725）。
2.3.2 其他指标A1—A3批sIPV的pH均值为7.1，蛋白含量均值为2.1 µg/剂，Vero细胞蛋白残留量均＜6 µg/剂，牛血清白蛋白残留量均＜1 ng/剂，Vero细胞DNA残留量均＜50 pg/剂，游离甲醛含量均＜ 0.5 µg/剂。B1—B3批sIPV pH均值为7.0，蛋白含量均值为2.1 µg/剂，Vero细胞蛋白残留量均＜6 µg/剂，牛血清白蛋白残留量均＜1 ng/剂，Vero细胞DNA残留量均＜50 pg/剂，游离甲醛含量均＜0.5 µg/剂。各检测项目的检测结果均符合药典三部相关要求及企标的要求。
2.4
远效期和近效期无酚红sIPV成品免疫效果分析
2.4.1 效力A1—A3和M1—M3批sIPV的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型大鼠效力试验ED50均值分别为4.75、3.73、4.08和4.79、4.03、4.35，相对效力分别为1.21、1.24、1.22和1.22、1.20、1.11。近效期组与远效期组的大鼠血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型阳转率均达到100%。经t检验分析，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型相对效力差异均无统计学意义（t值分别为-0.15、0.89、2.17，P值分别为0.888、0.424、0.096），表明贮存36个月后无酚红M199对产品效价无影响。
2.4.2 免疫原性A1—A3和M1—M3批sIPV组的一免阳转率均为100%，免疫后抗sIPV Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体的GMT均显著上升（图3），中和抗体水平差异无统计学意义（t值分别为-1.46、2.02、0.03，P值分别为0.219、0.113、0.976）。结果表明，近效期与远效期无酚红sIPV免疫原性趋势一致，且均有较好的免疫原性。
3
M199培养基作为sIPV重要的稳定剂和保护剂，其含有的氨基酸和缓冲液等能够稳定抗原结构，维持制剂的稳定，对产品质量有至关重要的作用。在sIPV制剂中，用无酚红M199替换含有酚红的M199，以去除制剂中可能干扰生物检测的非目标成分酚红，需要对成品的理化性质、有效性及效期等进行进一步的验证。
本研究结果显示，无酚红M199贮存0至42个月的长期理化性质及微生物指标均合格，各项指标稳定。用贮存36个月并检定合格的无酚红M199制备的sIPV放行检测项目均合格。D抗原作为关键有效抗原能刺激机体产生抗体，其含量与体内免疫原性有较好的一致性。本研究还拓展研究了无酚红sIPV的稳定性及免疫原性，证实使用近效期与远效期无酚红M199制备的sIPV质量属性一致、稳定性趋势一致，均能诱导大鼠产生针对Sabin株脊灰病毒的中和抗体，表明贮存36个月后无酚红培养基制备的sIPV成品仍具有较好的免疫原性，与文献[10-12]报道一致。本研究证实，用近效期即贮存36个月的无酚红M199制备的sIPV成品有效且质量可控，为无酚红M199制备sIPV成品的质量属性控制提供了初步研究依据。
作者
刘英微1 刘哲宇2 田东阳1 李建新3 张萌3 李娜4
1北京生物制品研究所有限责任公司课题一组， 北京 100176；2北京生物制品研究所有限责任公司质量检定室， 北京 100176；3北京生物制品研究所有限责任公司疫苗五室， 北京 100176；4北京生物制品研究所有限责任公司质量保证部， 北京 100176
引用本文：刘英微, 刘哲宇, 田东阳, 等. 用于Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗生产的无酚红M199培养基贮存效期验证 [J].国际生物制品学杂志, 2025, 48(1): 20-25.
DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240223-00009
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