读：流感病毒的季节性流行造成了重大的全球公共卫生负担，接种疫苗仍然是预防感染的最有效方法。mRNA作为新兴技术，在流感疫苗领域展示出了极大的潜力，其可安全高效制备，可更好地面对流感抗原漂移而造成的疫苗效力降低。
2024年10月，辉瑞疫苗开发团队Teresa Hauguel等在NPJ Vaccines（Q1, IF=6.9）期刊上发表了一篇题目为《Preclinical immunogenicity and safety of hemagglutinin-encoding modRNA influenza vaccines》的文章，提出其根据COVID-19mRNA疫苗BNT162b2平台技术和脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticles, LNP)制备工艺，制备了编码血凝素(Hemagglutinin-encoding，HA)的核苷修饰mRNA疫苗，并分别在小鼠、大鼠、恒河猴和食蟹猴多种动物模型中评估了其临床前免疫原性和安全性。今天，由小编带大家一起走进这篇文章。
发表期刊:NPJ Vaccines
发表时间: 2024年10月
影响因子: 6.9
应用技术: mRNA-LNP、流式细胞术、ELISA 测定、下颌下出血技术、血凝素抑制试验 (HAI)、微中和试验(MNT)、 细胞因子染色法、动物组织切片等实验。
01
流感概述
流感是一种严重的病毒性呼吸道疾病。常见的季节性流感疫苗多用于甲乙两型流感菌株的预防，具体谱系为H1N1和H3N2 2种甲型流感亚型，以及B/Yamagata和B/Victoria 2种乙型流感亚型。在流感中，HA是甲型流感(Influenza A viruses, IAV)和乙型流感病毒(Influenza B viruses，IBV)表面最丰富的糖蛋白,是病毒中和抗体的主要靶标，也是流感疫苗的关键抗原。HA蛋白负责识别病毒并将其附着在唾液酸受体上，从而介导病毒进入宿主细胞。随着时间推移，HA表面蛋白会发生抗原漂移，所以需及时更新季节性流感疫苗。mRNA疫苗已在COVID-19期间，体现了其生产速度快、成本效益高的优势，如果将其应用于流感，会助力于季节性流感疫苗更新，并能大大降低疫苗错配的风险。
02
mRNA流感疫苗的制备与表达
文中，mRNA流感疫苗的HA编码序列来源于以下四种流感毒株：A/Wisconsin /588/2019(H1N1)、A/Darwin/6/2021(H3N2)、B/Austria/1359417/2021(B/Victoria)和B/Phuket/3073/2013(B/Yamagata)菌株，优化后的mRNA序列被包封在LNP中。如图1流式结果所示，流感HA蛋白在编码菌株特异性HA抗原的mRNA中以剂量依赖性方式在HEK-293T细胞中表达。而且，无论几价疫苗(单价(Monovalent, mIRV）、三价(Trivalent, tIRV)和四价(Quadrivalent, qIRV))都可以在IAV和IBV中有效表达HA蛋白。
图1 mRNA流感疫苗的表达情况
03
单价mRNA流感疫苗的免疫原性
为了评估单价HA mRNA流感疫苗的免疫原性，作者分别在小鼠、食蟹猴和恒河猴上评估了mIRV疫苗的功能性抗体反应和多功能T细胞反应情况。通过在小鼠身上间隔28天给药两剂编码来自A/Wisconsin/588/2019(H1N1) HA抗原的mIRV疫苗或阳性对照Fluad®对其进行免疫。根据血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition assay, HAI)、微量中和试验(Microneutralization assay test, MNT)，作者发现两种疫苗在小鼠身上诱导了相似的体液免疫情况。同时，mIRV疫苗还诱导了更高水平的CD4+T和IFN-γCD8+T细胞反应。作者在非灵长类动物(Non-human primates, NHP)身上也发现了类似的实验结果。从研究的第105天到第168天，恒河猴和食蟹猴的HAI和MNT滴度都趋于稳定，保持与首次给药后（第21天）相当的水平。因此，作者认为含有HA的单价mRNA疫苗会在小鼠和NHP中引起强大而持久的体液和细胞免疫反应。
图2单价mRNA流感疫苗在小鼠和NHP的免疫原性研究
04
多价mRNA流感疫苗的免疫原性
文章进一步评估了两剂三价/四价疫苗在小鼠中的免疫原性情况。qIRV（四价疫苗）编码的HA分别来自世卫组织推荐的用于2021-2022年北半球流感季节的A/Wisconsin/588/2019(H1N1)、A/Cambodia/e0826360/2020(H3N2)、B/ Washington/02/2019(B/Victoria)和B/Phuket/3073/2013(B/Yamagata)4种菌株。作者用两剂qIRV对小鼠进行免疫，在第二次免疫的两周后，通过HAI测量针对疫苗编码的四种毒株中的每一种的功能性抗体和MNT。
结果显示，与阳性对照相比，qIRV免疫诱导的针对H1N1和H3N2的HAI和MNT滴度具有较高的统计学意义。而且，三价mRNA疫苗与单价和四价疫苗相比，针对H1N1诱导了相似的病毒中和滴度。此外，作者还通过与单价mIRV比较，评估了多价疫苗中各mRNA病毒株表达之间的干扰情况。在第二次免疫两周后，通过MNT测量针对疫苗匹配毒株的病毒中和滴度。结果，mIRV、tIRV或qIRV在共享疫苗株（H1N1、H3N2和B/Vic）引发的中和滴度没有统计学差异，证明了多价疫苗之间不存在干扰性。
图3四价mRNA流感疫苗在小鼠中引发的抗体反应
05
单价和四价mRNA疫苗
在大鼠中的毒理学评价
5.1生理活动与血清学
为了评估单价（mIRV）和四价（qIRV）mRNA流感疫苗的安全性，作者在Wistar Han小鼠身上进行了系统的毒理学研究。雄性和雌性大鼠分别给予2剂mIRV或qIRV，间隔两周，分为给药期和恢复期组别，按规定时间实施安乐死后进行观察与评价。
首先，作者在重复剂量毒性研究中发现，大鼠对mIRV和qIRV的给药是耐受的，没有全身毒性，且没有与疫苗相关的死亡率、临床体征或眼底镜参数的影响。仅第4天时，在所有疫苗组的雄性大鼠中观测到了瞬时的体重降低，并在第8天恢复（图4）。同时，根据血清学结果，则可以了解到在给药和恢复阶段结束时，大鼠中可以检测到由mIRV和qIRV疫苗编码的所有病毒株HAI反应，而生理盐水对照组动物中未观察到血凝素抑制。
图4单价或四价mRNA流感疫苗接种后大鼠的体重和体温情况
5.2临床病理学与解剖病理学
随后作者发现，mIRV和qIRV在大鼠的关键临床病理观察上也是相似的表现，反映了接种疫苗后的预期免疫反应。血液学检查结果与炎性白细胞图一致，包括第3天和第17天的中性粒细胞计数较高，第17天高分段中性粒细胞的发生率较高，以及第3天和第17天更高的单核细胞、嗜酸性粒细胞和未染色的大细胞。两种疫苗的结果也与急性期反应一致。除较高的球蛋白和较低的白蛋白外，所有临床病理变化在恢复期结束时恢复。
最后作者在安乐死的大鼠身上，进行了组织病理学研究（图5）。结果发现，在注射部位观察到由LNP导致的相关细胞炎症和轻微水肿，但在恢复期结束时，基本实现完全恢复或炎症部分恢复。同时，文中也显示在引流淋巴结、腹股沟淋巴结中浆细胞的存在，以及脾脏和骨髓中发现免疫激活或炎症。此外，在给药期间大鼠引流淋巴结肿大，且引流淋巴结和腹股沟淋巴结中浆细胞、生发中心的细胞结构增加，而在恢复期结束时均实现一定程度的修复。
图5接种一价mRNA流感疫苗后大鼠的组织病理学特征
06
总结
疫苗是流感控制和预防的重要手段，不同于传统的流感疫苗的制造缓慢且疗效有限，mRNA疫苗具备快速生产大量疫苗的能力，并且成本低、耗时短、疫苗错配风险低。本研究中，依赖于原有的BNT162b2平台，辉瑞研究者搭建了一种编码HA全长蛋白的流感疫苗mRNA平台，单价及多价流感疫苗已在多种动物模型中体现了对流感病毒攻击的保护功效。小鼠和NHP研究模型的结果表明，流感mRNA-HA疫苗会引发多方面的免疫反应，其特征是强烈的HA特异性功能性、中和抗体反应以及细胞介导的免疫反应。同时，这一流感mRNA-HA疫苗平台在小鼠和NHP中诱导了强烈的T细胞反应。具体为在小鼠中，疫苗接种诱导Th1型CD4+和IFN-γCD8+ T细胞反应。此外，mRNA-HA流感疫苗也具有良好的耐受性，并且具备非不良事件发现和预期的炎症反应。上述实验均表明，mRNA疫苗代表了一种极具前途的方法，可以提高流感疫苗的有效性，以降低与季节性流感流行相关的发病率和死亡率。
参考文献
[1] Hauguel T，Sharma A，Mastrocola E，et al. Preclinical immunogenicity and safety of hemagglutinin-encoding modRNA influenza vaccines[J]. NPJ Vaccines, 2024, 9(1): 183.
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撰写| 工程菌星球
校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea
编辑 设计| Alice
