饶毅发表Cell子刊论文，发现迄今最重要的睡眠调控因子，开创睡眠研究新方法

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

睡眠是动物体内由昼夜节律和稳态过程共同调节的一项重要生理活动。在果蝇、小鼠、狗和人类身上采用的遗传学方法已被证明在揭示调控睡眠的基因方面十分有效。例如，包括在维持清醒方面发现的食欲素（也叫做下丘脑泌素）及其受体，以及在调节睡眠方面发现的盐诱导激酶 3（SIK3）。

由于睡眠只能在动物身上进行测量，而无法在分子层面进行，因此该领域的研究人员都依靠电生理学和遗传学来开启果蝇和小鼠睡眠分子及机制的研究。

2024年12月30日，饶毅教授团队在 Cell 子刊Cell Chemical Biology上发表了题为： Calcineurin: An essential regulator of sleep revealed by biochemical, chemical biological, and genetic approaches 的研究论文。

该研究以对睡眠至关重要的激酶的磷酸化位点为靶点，采用生物化学和化学生物学方法，发现盐诱导激酶 3（SIK3）第 469 位苏氨酸被丙氨酸取代（T469A）的小鼠的睡眠时间增加。钙调神经磷酸酶（CaN）在体外和体内均可使 SIK3 的 T469 和 S551 位点去磷酸化，但 T221 位点不受影响。敲除 CaN 的调节亚基PPP3R1，可使小鼠每天的睡眠时间减少超过 5 小时，这超过了所有已知的基因突变对小鼠睡眠时间的改变。

该研究揭示了钙调神经磷酸酶（CaN）在睡眠中具有关键的生理作用，并开创了生化纯化和化学生物学作为研究睡眠的有效方法。

对睡眠机制的研究传统上依赖于电生理学和遗传学。由于只能通过行为观察和物理手段来测量整个动物的睡眠，因此没有通过生化和化学生物学方法来开展睡眠研究。

在评估了这些策略的优势和局限性之后，饶毅团队决定尝试两种方法：一种是采用经典纯化方法的生化方法，另一种是采用化学生物学方法的化学生物学方法。研究团队的首个靶标底物是SIK3，此前筑波大学的柳泽正史团队以及饶毅团队已经发现其位点特异性磷酸化对睡眠调节十分重要。

由于SIK3中特定的磷酸化位点能够指示睡眠需求并参与睡眠调节，研究团队以该蛋白作为底物，通过生物化学方法鉴定其调控因子，然后测试这些体外磷酸化的生化调控因子是否也能调控动物的睡眠。

蛋白质磷酸化在不同的睡眠-觉醒相关状态下有所不同。哺乳动物的睡眠被认为与 PKA、ERK、AMPK、CaMKIIα、CaMKIIβ、JNK、SIK3、SIK1、SIK2，以及 LKB1 有关。 CaMK2b 基因敲除小鼠每天的睡眠时间减少超过 2小时，多于其他已知基因突变。

关于哺乳动物睡眠中的蛋白磷酸酶（PPase），目前仍知之甚少。20 世纪 70 年代发现的一种蛋白质Calcineurin（CaN），直到 80 年代才确定其作为磷酸酶的功能。CaN（钙调神经磷酸酶）是唯一一种由钙离子（Ca2+）和钙调蛋白（CaM）激活的磷酸酶，它是一种二聚体，由催化亚基钙调神经磷酸酶A（PPP3CA、PPP3CB 或 PPP3CC）和调节亚基钙调神经磷酸酶B（PPP3R1 或 PPP3R2）组成。PPP3CA、PPP3CB 和 PPP3R1 在体内普遍表达，而 PPP3CC 和 PPP3R2 在睾丸中发挥重要作用。PPP3CA 是大脑中含量最丰富的催化亚基，而 PPP3R1 则是含量最丰富的调节亚基。

在确定 SIK3 中一个特定磷酸化位点：苏氨酸（T）469的重要性后，研究团队开始寻找 SIK3 的蛋白磷酸酶（PPase）。虽然SIK1和SIK2中丝氨酸（S）551等效位点的缺失导致了与 SIK3 中 S551 位点功能增益相同的表型，但研究团队发现，Sik1 或 Sik2 基因的缺失并不影响小鼠的睡眠。因此，研究团队重点关注 Sik3 基因。

SIK3 在 T469 和 S551 位点的 PKA 磷酸化增加了 SIK3 与 14-3-3 蛋白的相互作用。14-3-3 蛋白结合抑制 SIK3，而 T469 或 S551 的缺失增加了 SIK3 信号传导。T469 的磷酸化的功能意义未知。

在这项最新研究中，研究团队构建了 SIK3 第 469 位的苏氨酸到丙氨酸突变（T469A），并发现 T469A 小鼠的睡眠增加。

我们采用了两种方法来寻找 SIK3 的 T469 和 S551 位点的蛋白磷酸酶（PPase）：一种是经典的生物化学方法，即从人 HEK293T 细胞中纯化 T469 和 S551 的蛋白磷酸酶；另一种是化学生物学方法，即在小鼠脑中对与 SIK3 相互作用的蛋白质进行光交联。这两种方法都发现了PPP3CA——钙调神经磷酸酶（CaN）的催化亚基。

体外实验表明，在存在钙离子（Ca2+）、钙调蛋白（CaM）和 PPP3R1 的情况下，PPP3CA 能够使磷酸化的 T469 和 S551 去磷酸化。PPP3CA 无法使磷酸化的 T221 位点去磷酸化，而该位点的磷酸化可促进 SIK3 的活性，以提示睡眠需求并促进睡眠。

在敲低 PPP3CA、PPP3CB 或 PPP3R1 的 HEK293T 细胞中，Ca 2+ 离子载体诱导的 T469 和 S551 位点的去磷酸化受到抑制，但 T221 位点的去磷酸化未受影响。当敲低 PPP3CA 或 PPP3R1 时，T469 和 S551 位点的磷酸化在小鼠脑内增加，而 T221 没有增加。PPP3CA敲低的小鼠，每天睡眠时间减少了大约3小时，PPP3R1敲低的小鼠，每天睡眠时间减少超过 5 小时，这超过了所有已知基因突变导致的小鼠睡眠变化。