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Introduction
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）易导致心脑血管疾病，是全球主要的健康问题。血脂异常会促进AS的发生和发展，目前抗AS的治疗策略主要集中在脂质方面，但血管新生也是AS斑块不稳定的重要因素。斑块内血管新生的患者通常具有斑块体积大和斑块负担大的特点，因此斑块血管新生可预测斑块进展的高风险。
川芎和赤芍是传统的中草药，也被用作膳食补充剂，在中国它们经常联合使用，有降脂和抗炎的作用。川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）和芍药苷（paeoniflorin，PF）分别是川芎和赤芍的代表性活性成分。TMP是一种吡嗪类化合物，存在于中国的黑醋和白酒中，而PF是传统上用于食用油生产的牡丹籽中主要的单萜苷。前期研究发现TMP和PF合用（TMP-PF）在体外通过抑制VEGF/VEGFR2和Jagged1/Notch1信号通路抑制氧化低密度脂蛋白诱导的血管新生，合用比单用更有效。然而，TMP-PF在体内是否能延缓AS进展、降低血脂、抑制斑块血管新生目前尚不清楚。
核受体4A1（nuclear receptor 4A1，NR4A1）是调节细胞周期和凋亡、脂质代谢和炎症等许多病理生理过程的转录因子。NR4A1也是VEGF途径介导的血管新生的重要转录因子，其沉默可显著抑制VEGF诱导的血管新生。以往的研究主要集中在NR4A1在AS炎症反应中的双向调节作用或NR4A1调节肿瘤生长和皮肤伤口愈合过程中的血管新生。然而，很少有研究关注NR4A1在AS斑块内血管新生中的作用。
本研究旨在确定TMP-PF在ApoE-/-小鼠体内的抗AS作用，并基于NR4A1的作用探讨TMP-PF抗AS的分子机制。
Results and Discussion
TMP-PF降低ApoE-/-小鼠血脂、延缓AS进展
与对照组相比，模型小鼠血清TC、TG、LDL-C水平显著升高， HDL-C水平显著降低（P＜0.05，图1A-D），而高剂量组、极高剂量组和辛伐他汀组小鼠血清TG水平显著降低（P＜0.05，图1B）；高剂量TMP-PF组小鼠LDL-C水平显著降低（P＜0.05，图1C），表明高剂量TMP-PF可能比其他剂量有更好的改善血脂作用。同时，与高剂量TMP-PF组相同剂量的TMP和PF均能降低TG和LDL-C水平（P＜0.05，图1B、C）。此外，HE染色显示，对照组小鼠主动脉壁厚度均匀、无斑块，模型小鼠主动脉壁厚度不均、斑块明显。TMP、高剂量TMP-PF和辛伐他汀可显著降低PA/LA比值、减少斑块面积，从而减缓AS进展（P＜0.05，图1E-F）。这些结果表明TMP-PF可能延缓ApoE-/-小鼠AS进展。
图1 TMP-PF改善ApoE-/-小鼠的血脂水平和斑块面积
TMP-PF抑制ApoE-/-小鼠斑块血管新生
AS模型小鼠血管新生标记物（CD31和vWF）在主动脉斑块中明显增加（P＜0.05，图2A-C）；TMP、PF、高剂量TMP-PF和辛伐他汀显著抑制CD31表达（P＜0.05，图2B），而vWF表达没有显著变化（P＞0.05，图2C）。由于高剂量TMP-PF对血管新生有更好的抑制作用，进一步评估了高剂量TMP-PF和相同剂量的TMP和PF对血管新生相关因子的影响。各组血清VEGF无显著性差异（P＞0.05，图2D）。模型组主动脉组织的VEGFR2和NR4A1表达明显增加（P＜0.05，图2E-G），而TMP、TMP-PF组主动脉组织VEGFR2表达明显降低，TMP、PF、TMP-PF、辛伐他汀组主动脉组织NR4A1表达显著降低（P＜0.05，图2E-G）。这些结果表明TMP-PF可以抑制ApoE-/-小鼠斑块血管新生、抑制NR4A1和VEGFR2表达。
图2 TMP-PF抑制ApoE-/-小鼠斑块血管新生和血管新生相关因子
TMP-PF通过抑制NR4A1表达降低血脂、延缓AS进展
与对照组比，模型组TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低、斑块面积增大（P＜0.05，图3A-F）；给药后TG、LDL-C水平显著降低、斑块面积减少（P＜0.05，图3B、C、E、F），而NR4A1激动剂（CsnB）可逆转药物作用（P＜0.05，图3B、C、E、F），提示TMP-PF可能通过抑制NR4A1表达降低血脂、延缓AS进展。
图3 TMP-PF通过抑制ApoE-/-小鼠NR4A1表达而改善AS
TMP-PF通过NR4A1/VEGFR2通路抑制斑块血管新生
AS模型组斑块中微血管密度（CD31表达）增加，NR4A1和VEGFR2表达增加；TMP-PF显著抑制CD31、NR4A1和VEGFR2表达（P＜0.05，图4A-F），而这些药物作用被NR4A1激动剂（CsnB）所逆转（图4A-F）。Western blot分析也显示，AS模型组主动脉NR4A1和VEGFR2表达明显增加；TMP-PF显著降低主动脉组织NR4A1和VEGFR2表达（P＜0.05，图 4G-I），而这些作用被NR4A1激动剂（CsnB）消除（图4G-I）。这些结果表明TMP-PF可能通过NR4A1/VEGFR2通路抑制斑块血管新生。
图4 TMP-PF通过抑制主动脉NR4A1/VEGFR2通路抑制ApoE-/-小鼠斑块血管新生
TMP-PF对ApoE-/-小鼠心肌组织学和心肌血管新生无明显副作用
由于抗血管新生治疗可能会增加心脏损伤的风险，进一步观察了TMP-PF对心肌组织学和心肌血管新生的影响。AS模型组小鼠心肌组织中有炎症浸润，但其他组中没有发现显著的变化（图5A）。CD31表达在各组心肌中没有统计学差异（P＞0.05，图5B-C），提示TMP-PF治疗后心肌微血管密度没有显著变化。这些结果表明，TMP-PF对ApoE-/-小鼠心肌组织学和心肌血管新生可能没有明显的副作用。
图5 TMP-PF对ApoE-/-小鼠心肌组织学和心肌血管新生无显著影响
Conclusion
不良饮食习惯可导致血脂异常和AS的发生，这可能会进一步引发心脑血管疾病。本研究发现，TMP-PF通过NR4A1/VEGFR2通路降低血脂、抑制斑块血管新生、减小斑块面积，从而改善AS（图6），表明TMP-PF具有降脂和抗AS的作用，对延缓AS进展和预防心脑血管疾病有积极的作用，这也增加了TMP-PF和它们的药草提取物作为食品、饮料和保健产品功能成分的可能性。
图6 TMP-PF通过NR4A1/VEGFR2通路降低血脂、抑制斑块血管新生从而延缓AS进展
第一作者
袁蓉，女，医学博士，助理研究员，主要研究方向为中西医结合防治心血管病。主持1项国自然青年基金项目和1项中国中医科学院优秀青年科技人才（创新类）项目，主研或参与国际级、国家级、省部级、院级课题10余项。已发表20篇SCI（以第一或共同第一作者、通信作者发表9篇），40余篇核心期刊论文（以第一作者发表23篇）。入选中国中医科学院优秀青年科技人才，曾获北京市优秀毕业生、北京中医药大学优秀博士学位论文、“岐黄杯”第十届全国中医药博士生优秀论文奖等。
通信作者
丛伟红，女，医学博士，研究员，博士生导师，主要研究方向为中西医结合防治心脑血管病和阿尔茨海默病。现任中国中医科学院西苑医院心血管病实验室副主任、国家（中医）心血管病临床医学研究中心实验室主任。从事中西医结合基础、临床研究及新药研发20余年，主持或主研参与国际、国家及省部级课题20余项，包括分别由亚太经合组织（APEC）、美国米尔斯坦亚美医学基金会（MMAAP Foundation）支持的迄今唯一的中医药项目，主编/参编著作7部。以一作或通讯作者等在国内外高水平期刊发表中英文论文80余篇，获中华中医药学会科学技术一等奖、二等奖及北京市、中国中医科学院科技进步二等奖，获得专利2项。曾获全国大型公益评选“荣耀医者”青年创新奖，入选全国中医药传承与创新“百千万”人才。
陈可冀，男，中国科学院资深院士，国医大师，中国中医科学院荣誉首席研究员及终身研究员，中国医学科学院及中国中医科学院学部委员，香港浸会大学及澳门科技大学荣誉博士。长期从事中西医结合心血管病与老年医学临床研究。现任国家中医心血管病临床医学研究中心主任，《中国中西医结合杂志》及Chinese Journal of Integrative Medicine杂志主编等。已发表中英文论文千余篇，学术著作10余部。曾获国家科技进步奖一等奖和二等奖、求是科技奖、何梁何利科技进步奖、首届世界中医药联合会首届中医药国际贡献奖、吴阶平医学奖、中国脑卒中防治工作卓越成就奖、全国杰出专业技术人才、中华中医药学会和中国中西医结合终身成就奖、全国中医药杰出贡献奖、“敬佑生命、荣耀医者”生命之尊奖、“最美医生”称号、转化医学杰出贡献奖等。
冷晓，男，理学博士，教授，主要研究方向为内科学、分子微生物和免疫学。约翰斯•霍普金斯大学医学院教授、约翰斯·霍普金斯老年和免疫重建中心主任，获美国国立卫生研究院（NIH）的多项基金资助。发表了160余篇科研论文，曾获免疫学与老年医学国际会议研究奖、美国老年病学协会默克新科研奖、老年病综合征研究AGS最佳论文奖、Paul Beeson老年病学研究奖、约翰霍普金斯大学医学院临床医学研究奖等。
Tetramethylpyrazine and paeoniflorin combination (TMP-PF) alleviates atherosclerosis progress by reducing hyperlipemia and inhibiting plaque angiogenesis via the NR4A1/VEGFR2 pathway
Rong Yuana,b, Qiqi Xina,b, Weili Shia,b, Yu Miaoa,b, Zhengchuan Zhub, Yahui Yuana,b, Ying Chenc, Xiaoning Chend, Sean Xiao Lenge,*, Keji Chena,b,*, Weihong Conga,b,*
a Cardiovascular Diseases Laboratory, Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100091, China
b National Clinical Research Center for Chinese Medicine Cardiology, Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100091, China
c School of Health Economics and Management, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
d Department of Otolaryngology, Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China
e Division of Geriatric Medicine and Gerontology, Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore 21224, United States
*Corresponding author.
Abstract
Atherosclerosis remains a great threat to human health worldwide. Previous studies found that tetramethylpyrazine (TMP) and paeonif lorin (PF) combination (TMP-PF) exerts anti-atherosclerotic effects in vitro. However, whether TMP-PF improves atherosclerosis in vivo needs further exploration. The present study aims to assess the anti-atherosclerotic properties of TMP-PF in ApoE-/- mice and explore the related molecule mechanisms. Results showed that TMP and high-dose TMP-PF decreased serum triglyceride and low-density lipoprotein cholesterol levels, suppressed vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) and nuclear receptor subfamily 4 group A member 1 (NR4A1) expression in aortic tissues, inhibited plaque angiogenesis, reduced plaque areas, and alleviated atherosclerosis in ApoE-/- mice. Also, TMP-PF exhibited a better modulation effect than TMP or PF alone. However, NR4A1 agonist abolished the anti-atherosclerotic effects of TMP-PF. In conclusion, TMP-PF was first found to alleviate atherosclerosis progression by reducing hyperlipemia and inhibiting plaque angiogenesis via the NR4A1/VEGFR2 pathway, indicating that TMP-PF had a positive effect on reducing hyperlipemia and attenuating atherosclerosis development.
Reference:
YUAN R, XIN Q Q, SHI W L, et al. Tetramethylpyrazine and paeoniflorin combination (TMP-PF) alleviates atherosclerosis progress by reducing hyperlipemia and inhibiting plaque angiogenesis via the NR4A1/VEGFR2 pathway[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(5): 2642-2652. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250212.
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编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
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