【Nature子刊】郑大一附院合作发文：有前景的脑血管病治疗策略

【导读】脑内出血（ICH）是严重类型的脑卒中，具有高死亡率和有限的选择治疗。

12月23日，郑大一附院与中国科学院以及台北医学大学研究人员合作共同在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“Sphk1/S1P pathway promotes blood-brain barrier breakdown after intracerebral hemorrhage through inducing Nlrp3-mediated endothelial cell pyroptosis”，本研究中，研究人员旨在研究Sphk1/S1P通路在脑出血后血脑屏障破坏中的作用，并评估抑制Sphk1在减轻这种破坏中的治疗潜力。结合人类患者样本、小鼠脑出血模型和体外细胞分析，研究人员评估了脑出血后Sphk1/S1P的表达水平和脑出血后BBB的变化。研究人员利用Sphk1抑制剂PF543和Sirna探讨该通路对血脑屏障完整性的影响及其潜在机制。Sphk1/S1P在脑出血后血肿周围脑组织中显著上调，并与BBB渗漏增加相关。在分子和超微结构水平，抑制Sphk1通过保留紧密连接蛋白和抑制内皮跨细胞转运来保护血脑屏障的完整性。此外，机制研究揭示Sphk1通过ERK1/2信号通路促进nlrp3介导的脑内皮细胞焦亡。综上所述，Sphk1/S1P通路在脑出血引起的血脑屏障破坏中起重要作用，抑制Sphk1/S1P通路有望成为脑出血治疗的新策略。

https://www.nature.com/articles/s41419-024-07310-4

背景信息

脑出血（Intracerebral hemorrhage， ICH）是全球范围内导致死亡和残疾的最具破坏性的脑血管疾病之一。虽然ICH仅占所有类型卒中的10% ~ 15%，但ICH 30天内的病死率高达50%，显著超过其他类型卒中。尽管在急性脑出血的外科干预和管理方面取得了重大进展，但仍没有有效的治疗方法来改善患者的功能结局。因此，迫切需要进一步阐明脑出血后继发性脑损伤的病理生理机制，为开发治疗干预措施铺平道路。

血脑屏障（blood-brain barrier， BBB）是由紧密连接的微血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞和神经元组成的一种高选择性生物屏障，可阻止有害物质和免疫细胞从血流进入脑组织。其中，脑微血管内皮细胞是BBB的重要组成部分。脑出血后，血脑屏障受到广泛而持久的损伤，导致血肿周围严重水肿，脑移位，甚至脑疝出。这加剧了脑出血后的继发性脑损伤过程，构成比初始出血更致命的威胁。既往对脑出血后BBB破坏的分子机制研究包括免疫浸润和炎症损伤，涉及β-Catenin、GSK-3β、水通道蛋白4 （AQP4）和基质金属蛋白酶9 （MMP9）等分子。然而，需要进一步的研究来了解ICH后脑微血管内皮细胞发生的分子改变。

Sphk1/S1P通路因其在炎症反应和神经元损伤中的作用而被认识，最近的研究强调了其在脑出血后的上调及其在促进神经元铁死亡中的作用。然而，Sphk1/S1P在脑出血后血脑屏障破坏中的作用尚缺乏研究。细胞焦亡是一种炎性细胞死亡途径，由Nlrp3介导，形成炎性小体复合体并激活Caspase-1，导致IL-1β和IL-18的释放。虽然Nlrp3在脑出血后神经炎症和损伤中的作用已被证实，但其对血脑屏障破坏的直接作用尚未被探讨。

抑制Sphk1可减少小鼠ICH后血肿体积、脑水肿和血脑屏障（BBB）渗漏

为了研究Sphk1表达升高在ICH后继发性脑损伤中的作用，研究人员给ICH小鼠注射了PF543，这是一种高度特异性、高效且与鞘氨醇竞争的Sphk1抑制剂，IC50为2 nM，Ki为3.6 nM。PF543对Sphk1的选择性高于Sphk2超过100倍。研究人员连续3天每天一次给ICH小鼠注射Sphk1抑制剂PF543，以抵消ICH后Sphk1的全部作用。正如预期的那样，接受PF543治疗的小鼠在ICH后血清S1P水平显著降低，这表明PF543在体内的有效性。尤其是，研究人员发现在ICH+PF543组中，通过PF543抑制Sphk1/S1P显著降低了血肿体积和脑水含量，而ICH+Vehicle组中则没有。此外，T2加权9.4 T MRI分析显示，ICH+PF543组小鼠的脑水肿显著减轻。ICH+PF543组小鼠的生存率高于ICH+空白对照组。ICH组和ICH+空白对照组的小鼠在ICH后3天内显示出明显的运动功能障碍。而且，在PF543治疗后，ICH+PF543组小鼠的运动功能障碍显著减轻，而ICH+空白对照组小鼠的运动功能障碍没有明显改善。

抑制Sphk1减少小鼠脑出血后血肿体积、脑水肿和血脑屏障（BBB）渗漏

此外，研究人员还进行了BBB渗漏实验，进一步研究Sphk1抑制对ICH后BBB完整性的保护作用。EB渗漏染色显示，与ICH+空白组小鼠相比，ICH+PF543组小鼠的EB渗漏显著减少，BBB破坏得到缓解。同样，HRP渗漏检查也显示，与ICH+空白组小鼠相比，ICH+PF543组小鼠的脑微血管HRP渗漏减少。双重IF染色显示，ICH或ICH+空白组小鼠的内源性小鼠IgG在周缘出血区显著渗漏。然而，Sphk1抑制显著减轻了这种渗漏。这些数据共同表明，Sphk1抑制对ICH后的BBB破坏具有保护作用。

在体外实验中，Sphk1通过ERK1/2信号通路促进脑内皮细胞中的NLRP3介导的细胞焦亡

为了确定Sphk1在脑内皮细胞介导的NLRP3依赖性细胞焦亡中的作用，研究人员在脑内皮细胞bEnd.3中模拟ICH后用Sphk1抑制剂(PF5-43)或si-RNA处理。PF5-43治疗在2μM和5μM浓度下显著降低了Sphk1和NLRP3的mRNA和蛋白水平，与未处理组相比。这伴随着细胞增殖增强和Cleaved-Caspase-1表达降低，表明细胞焦亡减少。

通过对Sphk1进行siRNA敲除，与阴性对照组相比，模拟ICH后，Sphk1和Nlrp3的mRNA和蛋白水平显著降低。这与细胞增殖增加和Cleaved-Caspase-1表达减少有关。

进一步研究ERK1/2信号通路发现，PF543和si-Sphk1治疗显著降低了ERK1/2的磷酸化水平（p-ERK1/2），而对照组（未治疗组）的p-ERK1/2水平则没有变化。ERK1/2抑制剂米达美替尼的使用也证实了这一发现，显示模拟ICH后p-ERK1/2水平降低，Nlrp3 mRNA表达减少。这些结果强调了Sphk1对ERK1/2磷酸化的调节作用及其下游对Nlrp3表达的影响。

结论

本研究强调了Sphk1/S1P通路在ICH后BBB破坏中的作用，尤其是通过介导NLRP3驱动的内皮细胞焦亡。本研究结果表明，抑制Sphk1/S1P通路可通过ERK1/2信号通路有效减轻内皮细胞焦亡。这些发现将Sphk1/S1P通路确立为治疗ICH的有吸引力的治疗靶点，值得在未来的研究中进一步探索。

【参考资料】

https://www.nature.com/articles/s41419-024-07310-4

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