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Abstract
以牛乳和羊乳为基础的婴儿配方奶粉（IF）是母乳喂养不足婴儿的替代食品。先前的研究报道了以牛乳、羊乳及两者混合乳为基础的婴儿配方奶粉的成分组成及理化稳定性。本研究进一步利用人类菌群相关（HMA）小鼠模型，探究这三种婴儿配方奶粉对肠道免疫及短链脂肪酸（SCFAs）生成的影响，并以人乳作为阳性对照。结果显示，羊乳基婴儿配方奶粉具有功能性免疫优势，表现为免疫相关细胞因子白细胞介素（IL）-2和IL-10水平升高、肠道通透性标志物D-乳酸和内毒素水平降低，以及肠道occludin和claudin的mRNA表达量增加。此外，羊乳基配方奶粉组小鼠肠道内乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐含量分别为12.06、2.42和1.72 μmol/g，分别达到人乳组水平的69%、79%和60。研究结果表明，羊乳基婴儿配方奶粉能改善肠道免疫功能并促进肠道短链脂肪酸的生成。
Introduction
作为婴儿的理想食品，母乳与健康发育密切相关。母乳喂养能有效预防婴儿疾病，构建健康的消化系统，形成良好的肠道菌群结构，并促进免疫系统的良好发育。免疫系统会对内外环境因素做出反应，并在生命周期中不断发展。新生儿对肠道感染的易感性主要归因于其免疫系统尚未成熟以及新生儿菌群诱导的定植抗性不足。新生儿至少在一定程度上依赖母体的抗体，尤其是源自母乳的抗体，来抵御频繁进入胃肠道的肠道病原体。
然而，在某些特定环境因素下，部分婴儿无法获得充足且适宜的母乳。婴儿配方奶粉（IF）被用作婴儿食品的主要替代品，以满足婴儿的营养需求。因此，补充婴儿配方奶粉喂养所带来的免疫益处，与婴儿免疫系统的成熟程度相关，甚至会对其长期健康产生影响。研究表明，母乳喂养比现有的婴儿配方奶粉能提供更好的免疫保护。母乳喂养因其丰富的成分，包括大量和微量成分，以及一些新发现的功能成分，可减少婴儿的肠道炎症、感染和过敏情况。
目前，牛乳和羊乳是生产婴儿配方奶粉的主要原料。然而，牛乳、羊乳和母乳在成分上存在巨大差异。这些成分上的差异可能会对婴儿配方奶粉与母乳在免疫成熟方面产生不同的影响。值得注意的是，羊乳与牛乳的酪蛋白水平有所不同。羊乳中的酪蛋白含量相对较低，而牛乳中的酪蛋白含量相对较高。酪蛋白含量高的食物往往会刺激婴儿胃部的胃酸分泌，导致酪蛋白凝结，从而延缓胃排空。牛奶中的酪蛋白主要分为 αs1 -酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。αs1-酪蛋白是主要的蛋白质过敏原，也是羊乳中的潜在致敏蛋白。然而，它仅占山羊乳中酪蛋白的5%，远低于牛乳中的含量。一项对源自牛乳和羊乳的αs1-酪蛋白致敏特性的研究表明，与羊乳组相比，牛乳组更容易出现辅助性T细胞2型炎症因子和转录因子表达增加，以及肠道屏障受损的情况。此外，β-酪蛋白是山羊乳中的主要酪蛋白。由于山羊乳中β-酪蛋白的分子结构往往高度无序，它提高了酪蛋白的消化率，从而降低了致敏性以及对免疫功能的不良影响。
基于牛乳和羊乳的配方奶粉在成分上的显著差异（源于原料乳的不同）可能对婴儿免疫成熟和肠道代谢产生不同影响。阐明这一问题将有助于确定适合生产接近母乳的配方奶粉的原料乳来源，以改善免疫功能。因此，利用人类菌群相关（HMA）小鼠模型，研究了不同乳基配方奶粉对血清生化指标、免疫功能相关细胞因子及肠道屏障免疫功能的影响。同时检测了各组小鼠肠道短链脂肪酸（SCFAs）的代谢水平，并分析了SCFAs代谢水平与免疫功能的相关性。基于本研究，探讨了不同乳基配方奶粉在免疫功能方面的潜在风险和益处。
Results and Discussion
体质量、器官指数变化以及组织病理学分析
各组小鼠的体质量变化和脏器指数变化如图1B和1C所示。所有小鼠的体质量最初均有所下降，随后稳步上升。建模期间小鼠的体质量减轻是受抗生素的影响，之后在喂养期间体质量恢复并逐渐增加。各组小鼠的脏器指数没有显著差异。所有小鼠的心脏指数在5.33～6.77之间；肝脏指数在39.43～46.57之间；脾脏指数在2.40～3.07之间；肺脏指数在7.34～8.98之间；肾脏指数在12.34～14.14之间。
图1 实验期间小鼠的生长状况
各组小鼠回肠和结肠的放大显微组织图像如图2所示。各组小鼠的肠道组织黏膜层上皮细胞完整，可见大量杯状细胞，肠腺排列整齐。此外，各组小鼠黏膜下层间隙大小均一，无明显病理变化。这些结果表明，婴儿粪便中的抗生素不会影响小鼠的肠道组织。源自牛乳、羊乳、混合乳和人乳的肠内配方奶粉也未导致典型的组织病理学异常。
图2 小鼠的组织病理学检查
小鼠血清炎症细胞因子水平
小鼠血清和粪便中的炎症细胞因子水平如图3所示。羊乳源肠内配方奶粉组小鼠的血清白细胞介素-2（IL-2）水平与人乳组无显著差异（P＞0.05），而牛乳源肠内配方奶粉组和混合乳源肠内配方奶粉组小鼠的血清IL-2水平则显著低于人乳组和羊乳源肠内配方奶粉组（P＜0.05）。各组小鼠的血清IL-4水平无显著差异（P＞0.05）。牛乳源肠内配方奶粉组和羊乳源肠内配方奶粉组小鼠的血清IL-9水平与人乳组无显著差异（ P ＞0.05），而混合乳源肠内配方奶粉组小鼠的血清IL-9水平显著低于人乳组。与牛乳源肠内配方奶粉组相比，羊乳源肠内配方奶粉组小鼠的血清IL-10水平显著升高，且达到了人乳组的检测水平。与喂育人乳的小鼠相比，牛乳源肠内配方奶粉组小鼠的血清分泌型免疫球蛋白A（sIgA）水平显著升高（P＜0.05），而羊乳源肠内配方奶粉组和混合乳源肠内配方奶粉组小鼠的血清sIgA水平则无显著差异（P＞0.05）。与喂育人乳的小鼠相比，三种肠内配方奶粉组小鼠的粪便sIgA水平均显著降低（P＜0.05）。这些结果，尤其是血清IL-2、IL-9和IL-10水平表明，食用羊乳源肠内配方奶粉的HMA小鼠的免疫力与喂育人乳的小鼠相似。
图3 羊乳源婴儿配方奶粉对小鼠免疫相关细胞因子的影响
肠道通透性指标
血清中的D-乳酸、二胺氧化酶（DAO）和内毒素水平被用于分析受损的肠黏膜通透性。不同乳源的肠内配方奶粉对小鼠肠道通透性的影响如图4A-C所示。与喂育人乳的组相比，牛乳源肠内配方奶粉组小鼠的血清D-乳酸水平显著升高（P＜0.05），而羊乳源肠内配方奶粉组和混合乳源肠内配方奶粉组则无显著差异（P＞0.05）。牛乳源肠内配方奶粉组和羊乳源肠内配方奶粉组的内毒素水平显著低于人乳组（P＜0.05）。三种肠内配方奶粉组小鼠的血清DAO水平显著高于人乳组（P＞0.05）。
图4 羊乳源婴儿配方奶粉对小鼠肠道通透性和紧密连接的影响
紧密连接蛋白相关mRNA的表达
为了进一步分析小鼠肠道屏障的免疫功能，研究了肠道紧密连接（ TJ ）相关蛋白 闭合蛋白 （ occludin ）、紧密连接蛋白-1（ZO-1）和克劳丁蛋白-1（ claudin-1 ）的mRNA表达情况，详细结果见图4D和4E。总体而言，牛乳源肠内配方奶粉组、羊乳源肠内配方奶粉组和混合乳源肠内配方奶粉组中紧密连接蛋白的表达水平显著低于人乳组。然而，与牛乳源肠内配方奶粉组相比，羊乳源肠内配方奶粉组中occludin和claudin-1的表达仍有显著增加。羊乳源肠内配方奶粉组中occludin的水平比牛乳源肠内配方奶粉组高3倍，达到了人乳组的66.5%。claudin-1的水平与occludin的水平相似，羊乳源肠内配方奶粉组中claudin-1的水平比牛乳源肠内配方奶粉组高5.1倍，达到了人乳组的70.0%。三种肠内配方奶粉组的ZO-1水平均显著低于人乳组，仅达到人乳组的4.1%至17.9%。
小鼠肠道短链脂肪酸的产生
短链脂肪酸（SCFAs）作为肠道微生物中一类极其重要的代谢产物，与个体健康密切相关。喂食不同乳源婴儿配方奶粉和人乳的小鼠肠道中短链脂肪酸的含量如图5所示。牛乳源婴儿配方奶粉组、羊乳源婴儿配方奶粉组和混合乳源婴儿配方奶粉组的短链脂肪酸（总量、乙酸、丙酸、丁酸）含量显著低于人乳组。乙酸、丙酸和丁酸是肠道微生物代谢产生的最为丰富的短链脂肪酸。与牛乳源婴儿配方奶粉组相比，羊乳源婴儿配方奶粉组和混合乳源婴儿配方奶粉组的丙酸和丁酸含量显著增加。与牛乳源婴儿配方奶粉组相比，羊乳源婴儿配方奶粉组的乙酸含量也显著增加。在肠道中检测到微量的异丁酸、戊酸和异戊酸，尤其是异丁酸和异戊酸，它们是蛋白质分解产生的支链短链脂肪酸。各组小鼠的异丁酸含量没有显著差异。相比之下，与牛乳源婴儿配方奶粉组相比，羊乳源婴儿配方奶粉组的戊酸和异戊酸含量显著增加。为了分析不同乳源婴儿配方奶粉对短链脂肪酸模式的可能影响，研究了每组小鼠肠道中特定短链脂肪酸的相对含量（图5B）。牛乳源婴儿配方奶粉组的乙酸比例相对较高，而羊乳源婴儿配方奶粉组的丙酸和丁酸比例相对较高，这更接近人乳组的短链脂肪酸模式。此外，人乳组中异戊酸的相对比例低于其他组。
图5 羊乳源婴儿配方奶粉对小鼠肠道短链脂肪酸生成的影响
短链脂肪酸、细胞因子、肠道通透性指标与紧密连接蛋白之间的相关性分析
短链脂肪酸被认为与肠道免疫稳态密切相关。因此，对短链脂肪酸与细胞因子、肠道通透性指标以及紧密连接蛋白（TJs）进行了相关性分析（图6）。细胞因子（IL-2、IL-10）与紧密连接蛋白（ocludin、claudin）呈显著正相关。相反，细胞因子和紧密连接蛋白与肠道通透性指标DAO呈负相关。有趣的是，主要的短链脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）与IL-2、IL-10、occludin和claudin之间存在正相关关系。此外，典型的IL-4与乙酸和丁酸呈显著负相关。
图6 短链脂肪酸、细胞因子、肠道通透性指标与紧密连接蛋白之间的相关性分析
Conclusion
综上所述，以羊奶为基础的婴儿配方奶粉饮食提高了细胞因子水平，降低了肠道通透性，并增强了紧密连接蛋白的表达。这些结果表明，以羊奶为基础的婴儿配方奶粉有助于婴儿肠道屏障功能的发育，尤其是机械屏障和免疫屏障。此外，以羊奶为基础的婴儿配方奶粉促进了无菌小鼠肠道短链脂肪酸产量的增加，主要是乙酸、丙酸和丁酸。本研究为以羊奶为基础的婴儿配方奶粉在调节肠道免疫稳态和代谢功能方面的作用提供了新的见解，并为以羊奶为基础的婴儿配方奶粉的应用提供了有力的证据。
Goat milk-based infant formula regulates intestinal barrier function and promotes the production of short-chain fatty acids
Qingxue Chena, Ting Caoa, Hongwei Tanga, Linyi Zhoub,c,d, Yuxuan Zhenga, Jinju Chenga, Bailiang Lia,*, Song Wanga,*
a College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
b College of Food and Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China
c Key Laboratory for Deep Processing of Major Grain and Oil, Ministry of Education, Wuhan 430000, China
d Hubei Key Laboratory for Processing and Transformation of Agricultural Products, Wuhan 430000, China
*Corresponding author.
Abstract
Infant formula (IF) based on cow milk and goat milk is a substitute food for infants who are underfed with human milk. In our previous study, we reported the composition and physicochemical stability of IF based on milk from cows and goats and a combination of both milks. Here, we investigated the effects of these 3 IFs on intestinal immunity and short-chain fatty acid production (SCFAs) using human microbiota-associated (HMA) mice and selected human milk as a positive control. The results showed that goat milk-based IF is associated with a functional immune advantage, due to the rise in the levels of immune-related cytokines interleukin (IL)-2 and IL-10, decreased levels of intestinal permeability markers D-lactic acid and endotoxin, and increased mRNA levels of intestinal tight junction proteins occludin and claudin. In addition, the intestine of mice fed with goat milk -based IF contained 12.06 μmol/g acetate, 2.42 μmol/g propionate, and 1.72 μmol/g butyrate, which reached 69%, 79 %, and 60% of the levels in human milk, respectively. Our results indicate that goat milk-based IF improves intestinal immune function and promotes the production of intestinal SCFAs.
Reference:
CHEN Q X, CAO T, TANG H W, et al. Goat milk-based infant formula regulates intestinal barrier function and promotes the production of short-chain fatty acids[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3150-3158. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250002.
翻译：王立磊（实习）
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
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