引言
酒精性脂肪肝（AFLD）是酒精性肝病的早期阶段，在全球范围内导致大量死亡，至今仍没有治疗 AFLD 的特效疗法。多糖是天然生物大分子，具有多种药理作用，同时也是生物体的能量来源和组成。来自于传统中药的天然多糖影响血脂调节，可能成为治疗 AFLD 的重要药物。山茱萸常用于治疗肝肾疾病，包括非酒精性脂肪肝和糖尿病肾病。
西北农林科技大学及空军医科大学药学院研究团队从山茱萸中分离出了一种新型酸性均质多糖 APFC-2，验证了APFC-2的结构特征及其对AFLD的作用机理，在《Carbohydr Polym》上发表《Structure characteristics of a novel pectic polysaccharide from Fructus Corni and its protective effect on alcoholic fatty liver》一文。
研究结果
一、山茱萸多糖的制备及其对酒精诱导的肝细胞的保护作用
建立了酒精诱导的人类肝脏 HepG2 细胞模型，评估 APFC 中提取的 APFC-1、APFC-2 和 APFC-3三种多糖对细胞增殖的影响，筛选出潜在的活性多糖。结果表明，用 CCK-8 法测定，HepG2 细胞在乙醇处理后活力明显下降。与 APFC-1 和 APFC-3 相比，APFC-2 具有浓度依赖性，可减轻乙醇诱导的细胞损伤。
二、APFC-2 的鉴定和成分分析
图1 APFC-2 的鉴定和成分分析
APFC-2 是一种酸性多糖。
三、APFC-2-R 的核磁共振分析
图2 APFC-2-R 的一维和二维核磁共振分析
四、APFC-2 的核磁共振分析
图3 APFC-2 的 NMR分析
通过核磁共振谱分析，APFC-2 是一种均相多糖，呈果胶样结构。
图4 APFC-2 的推导结构
根据单糖组成、甲基化和核磁共振数据，可以推断出 APFC-2 的结构。
五、APFC-2 对体内 AFLD 的治疗作用
图5 APFC-2 对体内 AFLD 的治疗作用
使用 30% 酒精诱导 AFLD 小鼠模型评估 APFC-2 对 AFLD 的体内治疗效果，正常对照组小鼠口服生理盐水，GSH作为阳性对照。APFC-2治疗模型组的肝脏指数明显高于正常对照组，表明AFLD模型建立成功。APFC-2能明显降低对照模型的肝脏指数，H&E染色显示，对照模型小鼠的细胞质空泡化、细胞核变窄和肝脏脂肪变性。使用 GSH 或 APFC-2 治疗四周后，酒精诱导的肝细胞损伤与载体对照模型相比有所减轻，与 GSH 相比，高剂量 APFC-2 治疗组对酒精诱导的肝损伤具有明显的保护能力。与酒精诱导的对照模型中血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的明显升高相比，APFC-2 治疗后这些血清指标降低。
评估血清脂质代谢物，包括胆固醇（CHO）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和甘油三酯（TG）。与正常对照组相比，载体对照模型组血清中的 TG、TC 和 LDL 水平明显升高，HDL 水平显著降低，而 APFC-2 可改善模型小鼠的脂质代谢产物。对照模型的血清 Glc 水平明显升高，而 APFC-2 处理的小鼠血清 Glc 水平则呈剂量依赖性下降。
这些结果表明，APFC-2 通过改善体内异常脂质代谢，保护肝细胞，对 AFLD 具有潜在的治疗作用。
六、APFC-2 可减轻酒精引起的体外脂质和葡萄糖代谢紊乱
图6 APFC-2 对 5 % 酒精诱导的 HepG2 细胞增殖和代谢平衡的影响
建立体外AFLD模型，将HepG2细胞在含5%酒精的培养基中培养24小时。CCK-8结果显示，用APFC-2处理的正常HepG2细胞的增殖无明显变化。与正常细胞相比，酒精诱导组的细胞活力降低，但APFC-2 在 0.03 至 30 mg/L 的浓度范围内对酒精诱导的细胞损伤具有抑制作用。
乙醇刺激后，HepG2 细胞内出现了明显的脂滴，但 APFC-2 可浓度依赖性地缓解脂质沉积，在 30 mg/L APFC-2 处理的细胞中，脂质含量显著下降。
酒精刺激细胞后，细胞内的FFA、TG和CHO含量显著增加，但APFC-2降低了酒精处理细胞内的FFA、TG和CHO含量。与对照组相比，模型组细胞内 CPT1 的含量降低，APFC-2 以浓度依赖性的方式抑制了这种降低。
LC-MS/MS 对暴露于酒精的 HepG2 细胞中的主要糖酵解代谢物（包括 G6P、FBP 和 GAPDH）进行检测，酒精明显抑制了这些糖酵解代谢物。
这些结果表明，APFC-2 可抑制细胞内脂质积累，促进酒精诱导肝细胞的糖酵解。
七、APFC-2 可抑制酒精诱导的 HepG2 细胞和 AFLD 小鼠肝脏中升高的 LKB1/AMPK 通路
图7 APFC-2 在酒精诱导的 HepG2 细胞和 AFLD 小鼠肝脏中
诱导 LKB1/AMPK 通路的激活
Western 印迹法定量检测 SREBP1 和 PPARα 的丰度，结果表明，酒精刺激细胞核和细胞质时 SREBP1 表达的增加分别被 APFC-2 的浓度依赖性降低。酒精刺激后 PPARα 的表达明显减少，而 30 mg/L 的 APFC-2 可使细胞核和细胞质中 PPARα 的水平增加。用 APFC-2 治疗后，模型小鼠肝组织中 SREBP1 和 PPARα 水平的变化与体外细胞实验中观察到的变化一致。
这些结果表明，APFC-2 通过减少脂质合成和增加脂质氧化来减少酒精诱导的脂肪积累。
通过测量 LKB1 和 AMPK 的磷酸化水平，进一步分析激活信号。酒精刺激后，HepG2 细胞中的 P-LKB1 和 P-AMPK 明显降低。APFC-2 浓度依赖性地增加了 P-AMPK 和 P-LKB1 的水平，30 毫克/升的 APFC-2 可使它们的表达量分别增加。
这些研究结果表明，APFC-2 可以有效地激活 AFLD 小鼠肝脏和酒精诱导的 HepG2 细胞中被酒精抑制的 LKB1/AMPK 通路。
八、APFC-2 通过 LKB1/AMPK 通路调节酒精作用下 HepG2 细胞的脂质代谢
图8 APFC-2 通过 LKB1/AMPK 通路调节酒精作用下
HepG2 细胞的脂质代谢
siRNA敲除HepG2细胞中的LKB1，Western印迹表明，敲除 LKB1 对总 AMPK 的表达没有明显影响，但 siLKB1 会明显下调其磷酸化水平。LKB1在AMPK活化过程中起着重要作用，而APFC-2能靶向LKB1调节AMPK信号通路。
测量 LKB1 敲除细胞中的胞内脂滴，酒精刺激后，siLKB1 细胞内脂质积累明显高于 siCon 细胞。APFC-2处理不能明显降低暴露于酒精的LKB1基因敲除细胞的细胞内脂质积累，表明APFC-2通过激活LKB1调控细胞内脂质沉积。在酒精诱导的细胞中，LKB1 敲除显著增加了 FFA、TG 和 CHO 的含量；APFC-2 处理并不能进一步改变 siLKB1 细胞中这些物质的含量。与 siCon 细胞相比，siLKB1 细胞中 CPT1 的水平在酒精暴露后明显下降，而 APFC-2 处理对酒精作用下 LKB1 敲除细胞中 CPT1 的水平没有明显影响。
这些结果表明，APFC-2 通过激活 LKB1 调节酒精诱导的 HepG2 细胞的脂质代谢。
通过CCK-8测定APFC-2靶向LKB1对细胞活力的影响，与 siCon 细胞相比，LKB1 基因敲除明显抑制了模型细胞的活力，但在酒精刺激下，APFC-2不能提高LKB1基因敲除细胞的活力，表明当细胞转染siLKB1时，APFC-2不能恢复酒精刺激导致的细胞活力下降。
这些结果证明，APFC-2可通过LKB1/AMPK途径缓解酒精引起的脂质紊乱和肝细胞损伤。
研究结论
本研究从山茱萸中分离纯化出了一种新型抗AFLD多糖APFC-2。APFC-2是一种典型的含有HG和RG-I结构域的果胶多糖，能够通过调节 LKB1/AMPK 信号通路，明显改善酒精诱导的 HepG2 细胞和 AFLD 小鼠肝脏的肝脂肪变性，表明 APFC-2 可作为一种潜在的新型抗 AFLD 药物。
注：文章仅用于学术交流，不作为任何商业用途。
版权归原作者和原发刊所有~
中医药基础科研服务：
相关咨询，加微信：1278317307。
【福利时刻】科研服务（点击查看）：、、、、、。咨询加微信：1278317307。
