福州大学生物与科学工程学院Cai Xixi（第一作者）、汪少芸教授（通信作者）等利用美拉德反应增强鲣鱼（Katsuwonus pelamis）蛋白水解物的咸味，并探讨其可能的机理，为经济鱼类保健食品的开发以及食品工程中非Na＋咸味替代品的开发提供参考。
Introduction
随着生活水平的提高，人们的饮食习惯逐渐趋向于“健康”，为平衡“健康”与“美味”的关系，食品工业中的调味工艺至关重要。咸味是5 种基本味觉之一，在人们的日常饮食中主要通过添加食盐来实现。盐的主要成分是NaCl，其中Na＋是人体不可缺少的必需矿物质元素，可以维持正常的渗透压，调节机体的水盐代谢。然而，长期摄入高钠盐不仅会严重影响内环境稳态，还会对心、肝、肾等脏器造成不同程度的损害。在食品加工行业中，不采取任何其他策略直接降低盐量会导致食品风味缺失、产品质地变差、保质期缩短等。因此，如何在不影响食品质量和风味的前提下减少盐的添加量成为研究热点。目前，减少盐摄入量的方法包括优化盐结构和分布、金属氯化物替代和添加风味增强剂。作为一种调味剂，咸肽显示出巨大的发展潜力。目前，已经从牛骨、罗非鱼副产物、草菇蛋白水解物等中制备并鉴定了咸肽和咸增强肽。
鲣鱼是一种广泛分布于热带和亚热带海域的经济海鱼。鲣鱼的传统用途是制作“鲣鱼片”，这是一种微咸的调味品，但制作过程复杂。多项研究表明，鲣鱼富含蛋白质和多种必需氨基酸，可以保证良好的营养平衡。本课题组以整条鲣鱼为原料，采用酶解法制备了含盐多肽。然而，水解产物的苦味和腥味成为进一步应用的障碍。因此，为了更好地利用鲣鱼的水解产物，有必要通过结构改造改善其风味。
美拉德反应已被证明具有改变感官特性的能力，这可能是提高鱼副产品可接受性的有效方法。研究表明，美拉德反应促进了风味化学的发展，打破了传统风味生产技术在调味品工业中的应用范围。
Results
1 鲣鱼水解物的美拉德反应产物（Maillard reaction products of Katsuwonus pelamis hydrolysates，M-KPSPs）制备条件优化
如图1所示，戊糖（核糖（ribose，Rib）和木糖（xylose，Xyl））的美拉德反应产物（Maillard reaction products，MRPs）的褐变程度高于己糖。不同的还原糖对KPSPs的咸味都有不同程度的增强，在测试的糖中，Xyl的影响最为显著，感官评分最高，为1.73。此外，根据感官评价人员的反馈，美拉德反应不仅增强了咸味的感知，而且降低了苦味的感知。美拉德反应速率的加快有助于形成更理想的风味，从而增强KPSPs的感官特性。因此，选择Xyl作为还原糖源进行后续优化。
字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
图1 不同还原糖对咸度的影响
研究不同反应条件对M-KPSPs咸味的影响，首先要考虑Xyl的引入量。如图2A所示，当KPSPs与Xyl的质量比为4∶1时，咸味强度最大。相反，在质量比为1∶4时，咸味强度最低。如图2B所示，当反应时间为150 min时，咸味强度达到最大值。随着反应时间从30 min延长到150 min，咸味和褐变程度都逐渐升高。
A. KPSPs与Xyl的质量比；B.反应时间；C.反应温度；D. pH值。
图2 不同反应条件对M-KPSPs咸度的影响
如图2C所示，当温度分别为80、90、100 ℃时，咸味无显著差异。因此，确定温度为80 ℃为最佳条件。如图2D所示，当pH值从5逐渐升高到7时，咸味强度也逐渐升高；但当反应pH值继续升高到7以上时，咸味强度保持相对稳定，无显著差异。
在单因素实验的基础上，选择Xyl添加量（A）、反应时间（B）和温度（C）作为独立变量，以咸味强度为反应参数（表1）。采用Design-Expert 8.0.6试用软件进行三因素三水平试验，结果如表2所示。通过回归分析，得到咸味度与各因素之间的关系为：咸味强度＝1.800＋0.092A＋0.130B＋0.160C＋0.095AB＋0.130AC＋0.340BC－0.200A2－0.260B2＋0.008C2
表1 响应面分析因素及水平
表2 响应面试验设计及结果
方差回归分析（表3）表明，模型极显著（P＜0.01），回归模型的R2为0.9235，表明模型拟合效果良好，可以用于预测制备工艺参数。最佳工艺条件为：KPSPs与Xyl的质量比为4.6∶1，反应时间为172 min，反应温度为88.67 ℃。在此条件下，盐度强度为2.20。为便于实际操作，将反应温度调整为89 ℃，制备出M-KPSPs，测得盐度强度为2.18±0.08。
表3 回归模型的方差分析
2 M-KPSPs的咸味增强
为表征美拉德反应前后咸味的变化，采用电子舌分析方法，结果如图3所示。PC1和PC2对累积方差的综合贡献率为96.9%，表明这2 个主成分能够有效地捕捉样品的整体味觉特征。
图3 电子舌验证美拉德反应前后咸度变化（A、C）及人工感官评价（B）
人工感官评价对味觉特征进行了评估（图3B）。感官评价结果表明，KPSP和M-KPSP的咸度呈现剂量依赖性关系。此外，M-KPSP的等效NaCl浓度始终高于相同质量浓度的KPSP，这与电子舌分析的结果一致。
3 KPSP和M-KPSP的热稳定性
图4A显示了不同加热温度对KPSPs和M-KPSPs溶液风味的影响。PC1和PC2的方差贡献分别为89.1%和9.3%。98.4%的累积方差贡献率表明样品中的大部分风味信息都被捕获。在60～100 ℃加热后，KPSP的咸味保持相对一致，咸味水平与20 mmol/L NaCl溶液相当。M-KPSP也表现出良好的稳定性，咸味与30 mmol/L NaCl溶液相当。如图4B所示，当加热时间超过20 min后，KPSP和M-KPSP的咸味均随着加热时间的延长而呈现增加的趋势，说明样品适合用于食品热处理过程中，咸味不会降低。
图4 不同加热温度（A）和加热时间（B）下KPSPs和M-KPSPs的热稳定性
4 KPSP和M-KPSP的结构变化
4.1 总氨基酸组成
测得KPSPs中总氨基酸含量为80.86%，M-KPSPs中为74.90%。如表4所示，美拉德反应导致KPSPs中疏水性氨基酸显著减少，从而导致苦味降低，增强咸味感知。
表4 KPSP和M-KPSP的氨基酸组成
4.2 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）
FTIR光谱进一步验证了KPSPs与Xyl的美拉德反应。图5A展示了KPSPs和M-KPSPs的FTIR光谱。在3427 cm－1附近观察到的光谱特征归因于羟基（—OH）官能团在受到拉伸应力时产生的拉伸振动。在美拉德反应之后，峰变得更宽，这可能是由于Xyl中的—OH引入到肽中。同时，M-KPSPs中位于1180～953 cm－1区域内的峰吸收发生了明显的变化，这是由于碳水化合物中C—H键的弯曲，C—C和C—O键的拉伸引起的，表明加热后肽与Xyl发生了结合。
图5 FTIR光谱（A）、荧光光谱（B）、肽的内源性荧光光谱（C）和圆二色光谱（D）分析KPSP和M-KPSP的结构变化
4.3 荧光光谱
图5B显示M-KPSPs在400～450 nm内的荧光强度明显高于KPSPs，符合美拉德反应产生荧光物质的典型特性。本研究中观察到的现象可能归因于通过美拉德反应生成的化合物。还表征了KPSPs和M-KPSPs蛋白质/肽的内源性荧光光谱（图5C）。M-KPSPs的荧光强度降低，说明与Xyl的共价反应遮挡了色氨酸残基的荧光信号，导致肽段内源荧光猝灭。在290 nm激发波长下，最大发射波长由353 nm红移至365 nm左右，说明肽链中氨基酸残基与Xyl发生了共价交联，色氨酸残基暴露在更加亲水的环境中。结果说明美拉德反应后KPSPs中肽段的空间结构发生了改变，变得更为松散。
4.4 圆二色光谱
如图5D所示，KPSP和M-KPSP中均没有α-螺旋结构。美拉德反应后，β-折叠相对含量由33.55%降至25.35%，无规卷曲由46.60%增至55.00%，表明蛋白质结构由有序变为无序。虽然没有直接证据表明无规卷曲结构的增加与风味变化之间存在联系，但无规卷曲的增加可能使多肽中疏水性的苦味氨基酸暴露出来，促进其与Xyl发生反应，导致苦味降低，咸味增加，这与内源荧光光谱的结果一致。
Conclusion
采用美拉德反应对KPSP进行咸味改良，其中KPSPs和Xly的MRP咸味最强，优化了反应条件，与KPSP相比，M-KPSP的咸味、可接受性和整体口感均有所提高。美拉德反应发生后，疏水性氨基酸浓度明显降低，导致苦味降低。此外，KPSPs和M-KPSP中大量的天冬氨酸和谷氨酸是咸味感知的重要贡献者。FTIR光谱、荧光光谱和圆二色光谱的结果证实了多肽和Xyl的共价结合。热处理过程中在KPSP中引入Xyl，增加了多肽的无规卷曲结构部分，松散了空间构象，促进了疏水性氨基酸的暴露和与还原糖的反应，从而减轻了苦味并提高了咸味。本研究结果表明，美拉德反应在增强咸味肽的咸味感知方面起着重要作用。利用酶水解和美拉德反应合成制备咸味海洋蛋白水解物有望在开发新型健康低钠的调味品中部分替代NaCl。
Abstract
Salt plays an important role in giving saltiness and adjusting taste in daily life. However, excessive intake of salt will cause certain harm to the body. Therefore, it has become an urgent need to develop new food processing strategies to reduce salt without reducing saltiness. In present study, Maillard reaction was employed to improve the flavor of Katsuwonus pelamis hydrolysates (KPSPs) with saltness. The change of flavor was measured by electronic tongue and sensory evaluation. After Maillard reaction of KPSPs and xylose, the bitter and other unpleasant flavor of the hydrolysates were reduced, whereas the saltiness and acceptability were enhanced significantly. The content of bitter amino acids of the Maillard reaction products of KPSPs (M-KPSPs) was reduced. Due to the covalent bonding between the peptide chain and the sugar molecules, the intrinsic fluorescence intensity was weakened with a redshift of the maximum emission wavelength, indicating that the tryptophan microenvironment became looser and more hydrophilic. The decrease in the composition of bitter amino acids and a change in the secondary structure of the peptides might lead to the change in the perception of flavor. The findings suggested that Maillard reaction affected the flavor characteristics, which provided a new idea for the improvement on non-Na+ saltiness of healthy food additives via Maillard reaction between protein hydrolysate and reducing sugars.
作者介绍
汪少芸 教授
福州大学生物科学与工程学院 院长
福州大学海洋科学与技术研究院 院长
2006—2009年在美国威斯康星大学和美国加州大学戴维斯分校从事博士后研究，现担任二级教授、博士生导师，福州大学生物科学与工程学院院长，福州大学海洋科学与技术研究院院长。入选全国“三八”红旗手、国家“万人计划”科技创新领军人才、国务院特殊津贴专家、科技部中青年科技创新领军人才、省A类高层次人才、省高层次创新人才、省科技创新领军人才。担任国家食品科学与工程“一流专业”负责人、省食品与生物工程“一流学科”带头人、省食品科学重点学科带头人、省海洋功能制品绿色制造“2011协同创新中心”主任、省海洋生物资源行业技术基地主任。担任Food Science and Human Wellness、Journal of Future Foods、Hans Journal of Food and Nutrition Science、《食品科学》和《食品工业科技》编委；担任中国食品科技学会理事会理事、福建省食品科技学会副理事长、《中外食品技术》首批翻译专家。主持承担省部级以上项目30余项。编写著作8 部，获授权发明专利79 件，发表SCI/EI收录学术论文230余篇，多篇论文获中国食品学会创新科技论文奖和福建省自然科学优秀论文一等奖。主持成果获国际食品功能因子（ICOFF）学术大会奖、中国产学研合作创新成果一等奖、全国食品产学研创新发展优秀科研成果奖一等奖、福建省科技进步一等奖、中国石油和化学工业联合会科技进步一等奖、福建省自然科学二等奖、福建省科技进步二等奖；获评中国食品科技学会科技创新-杰出青年、宝钢优秀教师、卢嘉锡优秀导师、福建省优秀教师、福建省优秀科技工作者。
编辑：管勤昊、阎一鸣； 责任编辑：刘莉
为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。
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