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Introduction
非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一种严重影响人类健康的慢性肝病。全球发病率约为25%，通常伴有其他代谢性疾病的发生，如2型糖尿病、动脉粥样硬化等。到目前为止，NAFLD的病因和发病机制尚不清楚，同时尚无FDA批准的治疗NAFLD的药物。因此，开发新型NAFLD药物正成为全球研究的热点。
柴胡来源于柴胡或狭叶柴胡的干燥根，临床上已实践用于治疗发热、寒战和炎症，以及作为保肝草药对抗各种肝病，包括慢性肝病和病毒性肝炎。从柴胡中分离得到的主要成分为柴胡皂苷、黄酮类、香豆素类、脂肪酸类和多糖类，其中柴胡皂苷是柴胡的主要生物活性成分。柴胡皂苷D（SSD）由于其在体内和体外的有效抗炎和保肝活性而引起了极大的关注。先前的研究表明，SSD降低了非酒精性脂肪性肝炎（NASH）大鼠的肝脏脂肪变性程度，改善了胰岛素抵抗和血脂异常。然而，口服SSD生物利用度低，胃肠道吸收差，难以解释其有益作用。因此，SSD口服给药的药理作用可能与SSD在胃肠道中影响的代谢物密切相关。本文的研究重点是探索柴胡皂苷D改善非酒精性脂肪肝病的深层机制。
Results and Discussion
SSD可减轻HFD诱导的高脂血症、肝损伤、胰岛素抵抗，改善肝脂肪变性
采用高脂饮食（HFD）喂养20周建立小鼠（C57BL/6J）NAFLD模型，在HFD喂养12周后，分别给予不同浓度的SSD（10和15 mg/kg·d）和200 mg/kg·d二甲双胍，每日一次，连续灌胃给药8周（图1A）。每周记录一次小鼠体质量，绘制体质量曲线。在给药第4周和第5周分别进行葡萄糖耐量（OGTT）和胰岛素耐量（ITT）实验，考察SSD对NAFLD小鼠血糖的影响。检测小鼠血清和肝脏生化指标TC、TG、HDL-c、LDL-c、AST、ALT，考察SSD的降脂和保肝作用。利用H&E和Oil Red O染色，观察小鼠肝脏组织脂滴大小，H&E染色考察脂肪组织脂滴大小情况。结果显示，SSD可以缓解HFD诱导的小鼠体质量增加（图1B、C）。SSD有效地降低了HFD处理的小鼠的肝脏和白色脂肪组织重量，对BAT没有显著影响（图1D-H）。同时，SSD显著减小HFD喂养小鼠中白色脂肪组织的大小（图1H）。肝脏组织H&E和Oil Red O切片染色结果发现SSD能减少肝脏脂滴的堆积（图1I）。此外，SSD处理的HFD喂养小鼠的eWAT和sWAT内的脂肪细胞尺寸更小（图1J-L）。SSD能减少肝脏和血清TC、TG、LDL-c、AST、ALT含量，提高胰岛素敏感性（图2）。综合以上结果，SSD能明显改善高脂饮食诱导的肥胖，血脂紊乱和胰岛素抵抗，在治疗NAFLD中有良好的疗效。
图1 SSD对HFD喂养小鼠体质量、肝脏和脂肪组织的影响
图2 SSD可减轻HFD诱导的NAFLD小鼠脂质紊乱和肝损伤
SSD对脂肪酸合成和FXR信号转导的调节作用
接下来，利用qPCR和Western Blot实验，考察了给予SSD肥胖小鼠肝脏有关脂质合成和脂肪酸氧化相关基因和蛋白表达水平的变化，另外也检测了肝脏和肠道关于胆汁酸合成代谢相关基因表达水平的变化。结果显示，SSD可以降低NAFLD小鼠肝脏脂质合成基因（Srebp1c、Fasn、Acaca、Scd1、Acly）和蛋白（SREBP1、AClY、ACC、FASN）的表达水平，明显增加NAFLD小鼠肝脏脂肪酸氧化基因（Pparɑ、Cpt1a、Pdk4）和蛋白（PPARɑ、CPT1A、ACOX1）的表达水平（图3A-C）。同时，SSD可以抑制肠道Fxr、Shp、Fgf15、Asbt mRNA表达水平，但似乎对肝脏Fxr、Shp表达以及肝脏胆汁酸代谢相关基因Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1、Cyp7b1 mRNA水平无明显影响（图3D-F）。由此说明SSD可能是通过抑制肠道FXR信号从而改善NAFLD小鼠肝脏脂质代谢的。
图3 SSD增加NAFLD小鼠肝脏脂肪酸氧化，抑制肠道FXR信号
SSD对总胆汁酸水平无显著影响，但降低了非结合胆汁酸含量
越来越多的证据表明，在NAFLD患者中经常观察到胆汁酸改变。因此，接下来研究了SSD是否可以调节胆汁酸-肠FXR信号传导从而治疗NAFLD。利用UPLC-MS/MS方法检测小鼠血清、回肠样本的总胆汁酸水平和胆汁酸谱，研究SSD对血清、回肠中相应胆汁酸的成分和含量的影响，确定特定胆汁酸对宿主代谢的调控机制。结果表明，SSD在10和15mg/kg剂量下均不影响总胆汁酸水平（图4A，图4F），SSD剂量依赖性地降低了非结合胆汁酸，升高了结合胆汁酸的比例（图4B-4C，G-H），但是初级和次级胆汁酸的含量没有显著变化（图4D-E、I-G）。接下来研究了SSD对单个胆汁酸种类的影响，结果显示，SSD可以有效调控胆汁酸的代谢稳态，显著上调回肠中具有FXR拮抗活性的T-β-MCA、T-CDCA和T-HDCA，显著下调回肠中具有FXR激动活性的CDCA和7-oxo-CA，从而选择性地抑制肠FXR活性，而不影响肝FXR信号传导（图4K-Q）。
图4 SSD处理小鼠胆汁酸代谢的变化
SSD影响参与胆汁酸代谢的肠道菌群功能
胆汁酸进入肠道并经历由肠道微生物群介导的一系列修饰。接下来，应用16S rRNA测序方法来研究这些胆汁酸变化是否与小鼠肠道微生物群有关。结果发现虽然SSD对小鼠肠道菌群总体结构无明显影响，但对特征益生菌/条件致病菌相对丰度产生明显作用，SSD剂量依赖性地增加了Akkermansia和Bacteroides，明显下调Clostridium、Odoribacter和Olsenella（图5A-M）。在物种水平上也观察到类似的结果，在物种水平上，SSD剂量依赖性地增加了Clostridium viride、Akkermansia muciniphila和Bacteroides stercorirosoris的相对丰度，并且降低了Clostridium scindens、Alistipes finegoldii、Odoribacter laneus、Olsenella profuse和Clostridium leptum的相对丰度（图5N）。提示这些菌株可能是SSD治疗NAFLD的关键菌株。
接下来，进一步将胆汁酸和肠道菌群结果进行相关性分析，发现SSD富集的Akkermansia muciniphila和Bacteroides stercorirosoris与非结合胆汁酸成显著的负相关，但与结合胆汁酸成正相关。Clostridium scindens和Clostridium leptum与非结合型胆汁酸成显著的正相关， 但与结合胆汁酸成负相关（图6A）。在肠道微生物群和回肠胆汁酸之间也观察到类似的相关性，Parasutterella excrementihominis与非结合的胆汁酸正相关（图6B）。此外，回肠中的7-oxo-CA和7-oxo-CA与其前体CA的比率与Clostridium leptum、Parasutterella excrementihominis和Alloprevotella rava成正相关，但与Clostridium viride成负相关（图6B）。总的来说，SSD通过改变肠道微生物群来改变胆汁酸代谢，这可能是SSD对NAFLD的治疗的机制。
图5 SSD处理小鼠肠道菌群的重塑
图6 特定肠道菌群变化与胆汁酸变化的相关性
SSD通过降低BSH活性诱导血清和回肠中结合胆汁酸的积累
甘氨酸或牛磺酸结合的初级胆汁酸在肠中通过BSH去结合为非结合胆汁酸，这是随后胆汁酸脱氢酶（7α/β-HSDH）和其他酶在7α/β-脱羟基反应中产生次级胆汁酸的先决条件（图7A）。搜索了肠道微生物群的酶委员会列表，以探索SSD对胆汁酸代谢中酶功能的影响。研究发现，SSD剂量依赖性地减少编码BSH和7α-HSDH的相关基因，这与SSD处理的小鼠中增加的结合胆汁酸和减少的非结合胆汁酸和7-oxo-CA水平一致（图7B-C）。此外，向体外粪便微生物群培养物中添加10和15 mmol/L SSD也以时间和剂量依赖性方式降低BSH的表达（图7D）。这些结果表明，SSD通过改变肠道微生物群结构来下调表达BSH的细菌，例如Clostridium。BSH水平降低导致牛磺酸结合胆汁酸水平升高，进而抑制肠道FXR信号通路改善NAFLD。
图7 SSD降低了BSH活动
Conclusion
总之，这些结果提供了强有力的证据，即SSD可以通过改变肠道微生物群的结构，特别是表达BSH和7α-HSDH的细菌，从而改变胆汁酸的组成，并最终通过抑制肠道FXR改善肝脏脂肪变性，在治疗NAFLD中发挥作用（图8）。本研究首次将SSD通过调节肠道菌群-胆汁酸-FXR代谢途径与NAFLD联系起来，为SSD在NAFLD治疗中的应用提供了实验依据。
图8 SSD通过肠道微生物-胆汁酸代谢途径改善NAFLD的机制示意图
01
第一作者
李岚，女，中国药科大学药物科学研究院药学专业在读硕士研究生，研究方向：非酒精性脂肪肝与骨质疏松。
02
第一作者
杨胜也， 女，中国药科大学药物科学研究院生药学硕士研究生，研究方向: 非酒精性脂肪肝。
03
第一作者
梁欣宇，女，南京中医药大学与中国科学院上海药物研究所联合培养在读硕士研究生，研究方向：非酒精性脂肪肝与肠道微生态调控。
04
通信作者
徐晓军，浙江大学“一带一路”国际医学院长聘教授，中国生物物理学会代谢生物学分会委员;中国生物化学与分子生物学会代谢分会委员;中国抗癌协会肿瘤代谢专业委员会委员;中国医促会认知障碍病学分会委员;国家自然基金生命科学部、医学部评审专家;教育部“新世纪优秀人才”。徐晓军教授聚焦“降脂中药发挥活性的物质基础及作用靶标”这个关键科学问题，从临床有效的中药中发现主要的降脂活性成分（群），利用多学科交叉方式鉴定降脂活性成分（群）的药效靶标（群），并深入研究降脂中药活性成分（群）的作用机制。通过以上工作，挖掘了降脂中药活性成分新的作用靶标，探索脂代谢调节的靶标/机制，并开发高脂血症、非酒精性脂肪肝等疾病的新药。近5年来，作为通讯作者已在Cell Metab.（2021），Nature Commun.（2023），Autophagy（2021），Cell Death Differ.（2022，2020），Phytother Res.（2021），Diabetologia（2018，2021），Theranostics（2018，2019），Biomed Pharmacother.（2019a，2019b），J Med Chem.（2021，2017），Biochem Pharmacol.（2016）等杂志发表SCI论文20余篇，近5年他引1500余次。
05
通信作者
谢岑，中国科学院上海药物研究所，原创新药研究国家重点实验室，研究员、课题组长，国家优青、国家海外高层次青年人才。主要研究方向为组织器官互作与调控功能，揭示了胆汁酸、短链脂肪酸、神经酰胺等多种代谢产物参与疾病进程的分子机制，提出了以肝-肠轴为核心的“肝病肠治”和“肠病肝治”新治疗观点，获得多个治疗代谢紊乱相关疾病的候选药物。近年来，以通讯或第一作者在Nature Medicine（2篇）、Cell Stem Cell、Cell Metabolism、Nature Communications，Hepatology和Microbiome等杂志发表近40篇研究论文。作为课题负责人承担国自然、科技部、中科院等项目共12项。兼任上海药理学会理事、上海市药理学会药效学专业委员会委员、中国药理学会分析药理学专业委员会青年常务委员、中国生物化学与分子生物学会代谢分会委员、中国生物物理学会代谢生物学分会青年理事等。
06
通信作者
郭小珍，女，中国科学院上海药物研究所助理研究员，研究方向: 代谢性疾病中糖脂代谢紊乱及调控机制研究。目前主持国家自然科学基金青年基金项目1项，参与国家自然科学基金面上项目、中国科学院战略性先导科技专项等多项。近5年来，在Analytica Chimica Acta（2023）、Kidney International（2021）、Journal of Hepatology（2022）、Hepatology（2021）、Journal of Agricultural and Food Chemistry（2018）等杂志发表SCI论文12篇，其中第一/共一作者或通讯作者5篇。
Saikosaponin D improves nonalcoholic fatty liver disease via gut microbiota-bile acid metabolism pathway
Lan Lia,1, Shengye Yanga,b,1, Xinyu Liangc,1, Yameng Liud, Hualing Xuc, Xiaozhen Guod,*, Cen Xiec,d,*, Xiaojun Xua,b,*
a State Key Laboratory of Natural Medicines, China Pharmaceutical University, Nanjing 210029, China
b Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China
c School of Chinese Materia Medica, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China
d State Key Laboratory of Drug Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China
1 Both authors contributed equally.
*Corresponding author.
Abstract
Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the main cause of chronic liver disease worldwide. Bupleurum is widely used in the treatment of non-alcoholic fatty liver, and saikosaponin D (SSD) is one of the main active components of Bupleurum. The purpose of this study was to investigate the efficacy of SSD in the treatment of NAFLD and to explore the mechanism of SSD in the improvement of NAFLD based on “gut-liver axis”. Our results showed that SSD dose-dependently alleviated high fat diet-induced weight gain in mice, improved insulin sensitivity, and also reduced liver lipid accumulation and injury-related biomarkers aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT). Further exploration found that SSD inhibited the mRNA expression levels of farnesoid X receptor (Fxr), small heterodimer partner (Shp), recombinant fibroblast growth factor 15 (Fgf15) and apical sodium dependent bile acid transporter (Asbt) in the intestine, suggesting that SSD improved liver lipid metabolism by inhibiting intestinal FXR signaling. SSD can significantly reduce the gut microbiota associated with bile salt hydrolase (BSH) expression, such as Clostridium. Decreased BSH expression reduced the ratio of unconjugated to conjugated bile acids, thereby inhibiting the intestinal FXR. These data demonstrated that SSD ameliorated NAFLD potentially through the gut microbiota-bile acidintestinal FXR pathway and suggested that SSD is a promising therapeutic agent for the treatment of NAFLD.
Reference:
LI L, YANG S Y, LIANG X Y, et al. Saikosaponin D improves nonalcoholic fatty liver disease via gut microbiota-bile acid metabolism pathway[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(5): 2703-2717. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250218.
本文编译内容由作者提供
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片来源：图虫创意
为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。
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